雌激素受體β激動(dòng)劑對肝硬化門靜脈高壓癥大鼠肝內(nèi)外血管床RhoA-ROCK和NO-PKG信號通路的影響.pdf

1、流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了雌激素具有對肝臟和血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。但是雌激素替代療法因其存在副作用限制其長期的應(yīng)用。目前發(fā)現(xiàn)雌激素受體β介導(dǎo)的雌激素效應(yīng)在肝臟和血管系統(tǒng)既有一定優(yōu)勢，又避免了其傳統(tǒng)的副作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)肝硬化PHT時(shí)，肝內(nèi)上調(diào)的RhoA/ROCK信號通路和NO的合成利用不足，NO/PKG通路激活障礙提高了肝內(nèi)血流阻力；而肝外循環(huán)系統(tǒng)ROCK的激活受限和 NO的產(chǎn)生過多導(dǎo)致了肝外血管的擴(kuò)張和高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)。在本研

2、究中，我們應(yīng)用雌激素受體β激動(dòng)劑DPN作用于CCl4誘導(dǎo)的肝硬化門靜脈高壓癥模型，研究DPN對于肝內(nèi)和肝外血管床中RhoA/ROCK和NO/PKG信號通路的激活情況，評價(jià)DPN對肝內(nèi)血流阻力和肝外高動(dòng)力循環(huán)以及腸系膜動(dòng)脈血管反應(yīng)性的作用，并且使用DPN干預(yù)體外培養(yǎng)的HSCs，觀察細(xì)胞的收縮和 RhoA/ROCK信號通路激活。探討DPN治療肝硬化PHT的可行性及機(jī)制，為雌激素替代治療肝硬化PHT提供理論依據(jù)和治療策略。
　　第一部分

3、：DPN對肝硬化PHT大鼠肝內(nèi)血管床RhoA/ROCK和NO/PKG通路的影響
　　目的：流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究提示雌激素對肝臟門靜脈系統(tǒng)具有保護(hù)作用，因此觀察雌激素受體β激動(dòng)劑DPN對（CCl4）誘導(dǎo)的肝硬化大鼠門靜脈壓力及肝內(nèi)RhoA/ROCK和NO/PKG通路的作用，探討DPN影響PHT的機(jī)制。
　　方法：使用DPN皮下注射去勢雌性大鼠，并設(shè)立假手術(shù)組、去勢肝硬化組和使用ERβ阻滯劑PHTPP組作為對照，HE染色和mass

4、ion評價(jià)各組大鼠的肝硬化發(fā)生情況，免疫組化和免疫印跡法檢測肝內(nèi)α-SMA的表達(dá)。測定各組門靜脈壓力，并使用RT-PCR、免疫印跡法檢測各組大鼠肝內(nèi)RhoA/ROCK和NO/PKG信號通路中 mRNA和蛋白的表達(dá)和磷酸化情況，并通過免疫組化和免疫印跡法檢測肝內(nèi)p-MLC(Thr18/Ser19)的水平評價(jià)肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化情況。
　　結(jié)果：①CCl4誘導(dǎo)的各組大鼠均形成不同程度的肝硬化和PHT，其中DPN干預(yù)組無論是肝

5、硬化程度還是門靜脈壓力都顯著低于去勢肝硬化組和PHTPP組，并且該組α-SMA的表達(dá)也較低，表明DPN抑制了HSCs的激活。②DPN不僅能降低該組大鼠RhoA、ROCK的mRNA和蛋白的表達(dá)，還能明顯下調(diào)p-moesin（Thr558）的表達(dá)來抑制ROCK的激活。③DPN可以明顯的提高eNOS的mRNA和蛋白的表達(dá)，提高p-eNOS的蛋白表達(dá)，抑制iNOS的蛋白表達(dá)提高肝內(nèi)NO的合成與利用，并能通過上調(diào)p-VASP（Thr239）水平激

6、活PKG。④DPN最終可通過下調(diào)p-MLC(Thr18/Ser19)的表達(dá)，抑制MLC的磷酸化水平，促進(jìn)肝內(nèi)血管平滑肌的舒張。
　　結(jié)論：①DPN能緩解CCl4大鼠的肝硬化程度，并能下調(diào)α-SMA，可能與DPN抑制HSCs的活化有關(guān)② DPN能通過抑制大鼠肝內(nèi)RhoA/ROCK信號通路的表達(dá)和激活，緩解肝內(nèi)血管床對縮血管物質(zhì)的高反應(yīng)性；DPN還能激活NO/PKG信號通路，提高NO的合成和利用，促使肝內(nèi)血管擴(kuò)張；最終可抑制MLC的磷

7、酸化，緩解肝內(nèi)血流阻力，降低門靜脈壓力。
　　第二部分：DPN通過抑制RhoA/ROCK信號通路的激活緩解肝星狀細(xì)胞的收縮
　　目的：觀察DPN對HSCs增殖、激活以及對ET-1介導(dǎo)的HSCs收縮的作用，并探討DPN緩解ET-1介導(dǎo)的HSCs收縮的機(jī)制。
　　方法：以ROCK阻滯劑Y-27632為對照，利用MTT法檢測各組藥物對HSC增殖的影響。采用膠原凝膠法評價(jià)DPN緩解ET-1介導(dǎo)的HSCs收縮的作用，并使用免疫熒

8、光和免疫印跡法檢測各組大鼠α-SMA的表達(dá)，ROCK的激活情況和MLC的激活情況。
　　結(jié)果：① DPN和Y-27632均對HSCs的增殖具有抑制作用，并呈劑量依賴關(guān)系。并且DPN濃度從10-7mol/L至10-10mol/L對應(yīng)Y-27632從10-5mol/L至10-8mol/L的抑制效果無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。②膠原凝膠收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10-7mol/L濃度的DPN對ET-1介導(dǎo)的HSCs的收縮具有明顯的抑制作用，使用阻滯劑后其

9、抑制作用消失，并且與10-5mol/L濃度的Y-27632的抑制效果相當(dāng)。③DPN能抑制ET-1介導(dǎo)的HSCs中α-SMA的表達(dá)；并且對ET-1介導(dǎo)的HSCs中p-moesin（Thr558）的表達(dá)具有抑制作用，但是其抑制作用不如Y-27632；而DPN對于ET-1介導(dǎo)的HSCs中p-MLC(Thr18/Ser19)的表達(dá)的抑制作用與Y-27632無顯著差別。
　　結(jié)論：DPN能呈劑量依賴關(guān)系抑制HSCs的增殖，并能抑制ET-1介

10、導(dǎo)的HSCs的活化。膠原凝膠實(shí)驗(yàn)提示DPN能明顯的抑制ET-1介導(dǎo)的HSCs的收縮，該作用與DPN能下調(diào)ROCK的激活，繼而抑制MLC的磷酸化水平有關(guān)。雖然DPN抑制ROCK激活的效果不如Y-27632，但抑制MLC的磷酸化水平和細(xì)胞收縮的最終效果與 Y-27632已無顯著差別，提示 DPN具有綜合效應(yīng)，其他機(jī)制也參與其中，需要進(jìn)一步探討。
　　第三部分：DPN對肝硬化PHT大鼠高動(dòng)力循環(huán)及腸系膜動(dòng)脈中RhoA/ROCK和NO/P

11、KG信號通路的影響
　　目的：針對肝硬化PHT時(shí)肝外血管床受體脫敏引起的ROCK激活受限機(jī)制和NO產(chǎn)生過多、NO/PKG過度激活的機(jī)制，觀察DPN對于去勢肝硬化PHT大鼠高動(dòng)力循環(huán)及腸系膜微動(dòng)脈血管反應(yīng)性的作用，并探討其作用機(jī)制。
　　方法：使用DPN皮下注射去勢雌性大鼠，并設(shè)立假手術(shù)組、去勢肝硬化組和PHTPP組作為對照，放射性微球法測定各組大鼠高動(dòng)力循環(huán)參數(shù)，并分離腸系膜微動(dòng)脈，使用血管灌流系統(tǒng)測定其對去甲腎上腺素（NE

12、）的反應(yīng)性，免疫印跡法檢測NE刺激后的各組大鼠腸系膜動(dòng)脈（MA）中ROCK的激活情況，β-arrestin-2表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平；檢測MAeNOS、p-eNOS、iNOS的表達(dá)和PKG的激活情況；并檢測MLC的磷酸化水平。
　　結(jié)果：① DPN改善了去勢肝硬化 PHT大鼠與高動(dòng)力循環(huán)有關(guān)的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，但對平均動(dòng)脈壓和全身血管阻力沒有影響②DPN干預(yù)組腸系膜微動(dòng)脈對NE的反應(yīng)性明顯高于去勢肝硬化組和PHTPP組，并且

13、去勢肝硬化組大鼠腸系膜微動(dòng)脈經(jīng)DPN孵育后，其反應(yīng)性也提高。③DPN提高了NE刺激的MA中moesin的磷酸化水平，降低了β-arrestin-2表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平β-arrestin-2表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平。④DPN對去勢肝硬化大鼠MA中eNOS、p-eNOS的表達(dá)沒有影響，但能抑制 iNOS的表達(dá)，下調(diào) p-VASP(Thr239)的激活⑤DPN能提高p-MLC（Thr18/Ser19）的表達(dá)，提高血管平滑肌的