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文檔簡介
1、內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)相關(guān)的并發(fā)癥如食管胃底靜脈曲張所致大出血是門靜脈高壓癥(portalhypertension,PHT)臨床常見且棘手的難題,是引起PHT病人死亡的重要原兇之一。內(nèi)臟動(dòng)脈對縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性所導(dǎo)致的血管擴(kuò)張是形成PHT高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)的關(guān)鍵,其原因在于血管平滑肌收縮信號(hào)通路發(fā)生障礙。研究顯示,提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,也不能改變PHT內(nèi)臟血管對縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性,由此說明RhoA/ROCK通路可能也同時(shí)參與了該機(jī)制。同時(shí)還
2、發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激參與了PHT內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)的形成,抗氧化劑在緩解PHT血管擴(kuò)張、高動(dòng)力循環(huán)中的作用越來越受到重視。但是,關(guān)于活性氧(ROS)在PHT內(nèi)臟動(dòng)脈對縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性以及高動(dòng)力循環(huán)中作用的相關(guān)研究較少,而且現(xiàn)有報(bào)道均未對氧化應(yīng)激在PHT內(nèi)臟動(dòng)脈對縮血管物質(zhì)低反應(yīng)性中的具體作用機(jī)制作深入研究。
在本研究中,我們首采用肌肉注射四氯化碳(CCl4)制備肝硬化PHT大鼠模型,顯微鏡下分離腸系膜微動(dòng)脈,檢測離體腸系膜微動(dòng)脈對縮
3、血管物質(zhì)反應(yīng)性的變化,然后將保留內(nèi)皮細(xì)胞的PHT微動(dòng)脈與去內(nèi)皮細(xì)胞正常大鼠微動(dòng)脈串聯(lián),在恒定血管內(nèi)壓、內(nèi)流下系統(tǒng)地測定從PHT內(nèi)皮細(xì)胞釋放的血管活性物質(zhì)尤其是ROS對下游正常血管平滑肌的收縮反應(yīng)性和RhoA/ROCK通路的影響。最后,通過降低PHT腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的合成和分泌后,觀察肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈收縮反應(yīng)性的變化,探討其對RhoA/ROCK通路的作用機(jī)制。通過上述研究,有助于完善微動(dòng)脈收縮信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制研究
4、,為臨床治療門靜脈高壓癥血流動(dòng)力學(xué)紊亂提供理論依據(jù)和新的思路。
第一部分肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素收縮反應(yīng)性的變化
目的:檢測肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素反應(yīng)性的變化,以及該現(xiàn)象是否與微動(dòng)脈釋放的血管活性物質(zhì)改變有關(guān)。方法:制備肝硬化PHT大鼠模型,術(shù)中測定門靜脈壓力,分離第三級(jí)微動(dòng)脈,分別利用單根或串聯(lián)血管灌流系統(tǒng)測定腸系膜微動(dòng)脈去內(nèi)皮前后對去甲腎上腺素的反應(yīng)。結(jié)果:①成功制備肝硬化P
5、HT大鼠模型。②肝硬化PHT大鼠門靜脈壓力(15.1±1.6)mmHg,遠(yuǎn)高于對照組大鼠(5.9±0.9)mmHg(P<0.01)。③肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移,EC50高于對照組,表明PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的敏感程度降低(P<0.01)。④肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移,EC50升高,表明肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈內(nèi)皮釋放
6、的某些血管活性物質(zhì)作用于正常大鼠的微動(dòng)脈平滑肌,使之對去甲腎上腺素的敏感程度降低(P<0.01)。結(jié)論:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素的收縮反應(yīng)性降低,這與PHT大鼠微動(dòng)脈內(nèi)皮增加或減少某些血管活性物質(zhì)的釋放有關(guān)。
第二部分肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)及酶活性測定
目的:通過比較肝硬化PHT大鼠和對照組大鼠腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路相關(guān)蛋白及酶活性的改變
7、,探討RhoA/ROCK通路在PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素收縮低反應(yīng)中的作用。方法:應(yīng)用免疫印跡法分別檢測兩組腸系膜動(dòng)脈RhoA/ROCK通路中α1腎上腺素能受體、Gαq/11、Gα12、Gα13、β-arrestin-2、RhoA和ROCK-1蛋白水平變化,以及moesin和p-moesin蛋白量的變化。應(yīng)用免疫共沉淀法檢測兩組腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用狀況。結(jié)果:①與對照組相比,肝硬化PHT
8、大鼠腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體、Gαq/11、Gα12、Gα13、RhoA和ROCK-1蛋白含量無明顯變化(P>0.05),ROCK-1蛋白酶的活性也無明顯變化(P>0.05)。②與對照組大鼠相比較,肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈β-arrestin-2蛋白量的表達(dá)升高非常明顯(P<0.01)。③與對照組大鼠相比較,肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用和結(jié)合的程度顯著升高(P<0.05)。結(jié)論
9、:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體、相關(guān)G蛋白以及RhoA、ROCK在蛋白水平?jīng)]有發(fā)生變化,ROCK的活性也未改變,但是β-arrestin-2蛋白水平上升,并且與α1腎上腺素能受體結(jié)合能力增強(qiáng)。
第三部分內(nèi)皮源性ROS對肝硬化PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈去甲腎上腺素反應(yīng)性的影響
目的:測定肝硬化PHT和正常大鼠腸系膜動(dòng)脈ROS的表達(dá)狀況,以及降低血管壁內(nèi)ROS的合成和分泌對血管去甲腎上腺素反應(yīng)性的影
10、響。方法:肝硬化PHT大鼠模型建立后,分別腹腔內(nèi)注射生理鹽水、apocynin(30mg/kg/d)、tempol(30mg/kg/d)和PEG-catalase(10000u/kg/d)共14天,正常大鼠組也相應(yīng)處理。術(shù)中測定門靜脈壓力,分離第三級(jí)微動(dòng)脈,DHE熒光染色法檢測血管組織中的ROS的生成,測定腸系膜動(dòng)脈H2O2含量,分別利用單根或串聯(lián)血管灌流系統(tǒng)測定腸系膜微動(dòng)脈去內(nèi)皮前后對去甲腎上腺素的反應(yīng)。結(jié)果:①術(shù)中門靜脈壓力測定顯示
11、PHT鼠無論是否接受抗氧化劑處理,其門靜脈壓力均顯著高于非PHT大鼠(P<0.01)。②正常組大鼠腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)膜(內(nèi)皮)、中膜和外膜紅色熒光強(qiáng)度較低,而PHT大鼠血管壁各層的熒光強(qiáng)度明顯升高,經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理后的腸系膜動(dòng)脈各層熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)。熒光強(qiáng)度定量圖顯示PHT組為最高,經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理后熒光強(qiáng)度降低,差異非常顯著(P<0.0
12、1)。③PHT組腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)H2O2含量顯著高于正常大鼠(P<0.01),PHT大鼠經(jīng)apocynin和PEG-catalase處理后,動(dòng)脈內(nèi)H2O2含量顯著降低(P<0.01),然而經(jīng)tempol處理后腸系膜動(dòng)脈內(nèi)H2O2含量變化不明顯(P>0.05)。④肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移,EC50高于正常組,經(jīng)apocynin和PEG-catalse處理后,離體腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線左
13、移,EC50減小(P<0.01),表明經(jīng)apocynin和PEG-catalse處理的肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的敏感程度增加。而經(jīng)tempol處理后,劑量反應(yīng)曲線和EC50變化不明顯(P>0.05),表明tempol不能改變肝硬化PHT大鼠的腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的低反應(yīng)性。⑤肝硬化PHT大鼠的離體腸系膜微動(dòng)脈能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線右移,EC50升高,經(jīng)apocynin和PEG-cata
14、lase處理后,能使下游去內(nèi)皮正常鼠微動(dòng)脈對去甲腎上腺素劑量反應(yīng)曲線左移,ECs0降低(P<0.01),而經(jīng)tempol處理后,變化不明顯(P>0.05)。結(jié)論:CCl4致肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈以及內(nèi)皮ROS含量升高,抗氧化劑apocynin和PEG-catalase都能降低動(dòng)脈壁和內(nèi)皮O2-和H2O2的含量,從而改善PHT腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的低反應(yīng)性;但是tempol僅能降低動(dòng)脈壁和內(nèi)皮O2-的含量,H2O2水平仍高,PHT
15、腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的反應(yīng)性仍低。H2O2的濃度上升降低了肝硬化PHT腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素的反應(yīng)性。
第四部分肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈ROS對RhoA/ROCK通路的影響
目的:分析抗ROS處理后,肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈對去甲腎上腺素反應(yīng)性改善的機(jī)制。方法:應(yīng)用免疫印跡法分別檢測正常大鼠、肝硬化PHT大鼠以及分別經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalase處理后,腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受
16、體和β-arrestin-2蛋白量的變化,經(jīng)去甲腎上腺素刺激前后各組腸系膜動(dòng)脈RhoA、ROCK-1、moesin和p-moesin蛋白量的變化。應(yīng)用免疫共沉淀法檢測各組腸系膜動(dòng)脈α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2相互作用狀況。結(jié)果:①各組腸系膜動(dòng)脈的α1腎上腺素能受體含量未發(fā)生明顯變化(p>0.05)。②經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后,肝硬化PHT大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)β-arrestin-2蛋白量降低(P<
17、0.01),但經(jīng)tempol處理后,PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)β-arrestin-2蛋白變化不明顯(P>0.05)。③經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后,肝硬化PHT大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)α1腎上腺素能受體與β-arrestin-2結(jié)合水平降低(P<0.01),但經(jīng)tempol處理后,PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)α1腎上腺素能受體結(jié)合β-arrestin-2蛋白變化不明顯(P>0.05)。④去甲腎上腺素刺激前后各組腸系膜動(dòng)脈RhoA
18、和ROCK-1蛋白量無明顯變化(P>0.05)。⑤肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈經(jīng)去甲腎上腺素刺激前后moesin和p-moesin蛋白量變化不明顯(p>0.05),經(jīng)tempol處理后無明顯變化(p>0.05);經(jīng)apocynin或PEG-catalase處理后,肝硬化PHT大鼠腸系膜動(dòng)脈受去甲腎上腺素刺激前后雖然moesin蛋白量無明顯變化,但是p-moesin蛋白量明顯升高(p<0.01);正常大鼠無論受何種處理,腸系膜動(dòng)脈受去甲腎上
19、腺素刺激前后p-moesin蛋白量均明顯升高(p<0.01)。結(jié)論:apocynin和PEG-catalase降低腸系膜動(dòng)脈壁內(nèi)β-arrestin-2蛋白量以及與α1腎上腺素能受體間的相互作用,改善了依賴G蛋白的信號(hào)通路傳遞障礙,促使激動(dòng)劑誘導(dǎo)ROCK激活,但不影響RhoA/ROCK信號(hào)通路中RhoA和ROCK蛋白量的變化,tempol無上述作用。
第五部分Y-27632對內(nèi)皮源性ROS引起PHT腸系膜微動(dòng)脈反應(yīng)性變化的影響
20、
目的:探討ROCK在內(nèi)皮源性ROS調(diào)節(jié)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管平滑肌收縮能力中的作用。方法:肝硬化PHT和對照大鼠分別經(jīng)apocynin、tempol和PEG-catalse處理,分離第三級(jí)微動(dòng)脈,經(jīng)過或未經(jīng)過Y-27632孵育后,利用單根血管灌流系統(tǒng)測定腸系膜微動(dòng)脈對去甲腎上腺素反應(yīng)性的變化。結(jié)果:①不管是正常大鼠,還是肝硬化PHT大鼠或經(jīng)抗氧化劑處理的大鼠,Y-27632顯著抑制去甲腎上腺素引起的腸系膜微動(dòng)脈收縮(p<0.01
21、)。②Y-27632對肝硬化PHT大鼠的腸系膜微動(dòng)脈收縮抑制能力最強(qiáng),遠(yuǎn)高于正常大鼠(p<0.01);經(jīng)Apocynin和PEG-catalase處理后,Y-27632對肝硬化PHT大鼠微動(dòng)脈收縮抑制能力減弱(p<0.01),而tempol不能改變Y-27632對肝硬化PHT大鼠微動(dòng)脈的收縮抑制能力(p>0.05)。結(jié)論:①RhoA/ROCK信號(hào)通路參與了大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌的收縮機(jī)制。②腸系膜動(dòng)脈內(nèi)ROS尤其是H2O2的濃度上升,阻礙
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