17-β雌二醇對高眼壓視神經(jīng)保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：青光眼(glaucoma)是一組以視神經(jīng)凹陷性萎縮和視野缺損為共同特征的不可逆性致盲性眼病，其病理基礎是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的進行性凋亡。傳統(tǒng)的機械學說和缺血學說并不能完全解釋青光眼神經(jīng)退變機理。流行病學顯示閉角型青光眼(primaryangle-closureglaucoma，PACG)女性發(fā)病率約為男性的2～4倍，發(fā)病年齡多在50歲以上。而在原發(fā)性開角型青光眼(primaryopen-angleglaucoma,POAG)男性發(fā)病

2、率明顯高于女性，50歲以后差距變小。這種性別差異是否提示青光眼和性激素的水平之間存在一定的關系?近年研究表明，雌激素對受損的神經(jīng)元，雌激素可以通過減少小膠質細胞(microglia,MG)氮氧化合物的表達和過氧化物的釋放，抑制小膠質細胞的吞噬作用等方面起到有效的神經(jīng)保護作用。小膠質細胞是視網(wǎng)膜中最具代表性的免疫細胞。近年諸多學者認識到免疫學因素尤其是小膠質細胞參與了青光眼視神經(jīng)病變的病理生理過程。活化后的小膠質細胞對視神經(jīng)具有一定的保護

3、作用，但其分泌產(chǎn)物如腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)α等卻與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡有密切聯(lián)系。目前國內(nèi)外關于雌激素對高眼壓作用下的視神經(jīng)是否具有保護作用及對TNF-α含量的影響未見報道。
　　 本實驗通過采用前房加壓灌注法制成急性高眼壓模型，并加以17β-雌二醇(17-βestrαdiol，17βE2)腹腔注射進行干預，應用計算機圖像分析技術和免疫組化技術對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和TNF-α的表達進行半定量

4、測定，并應用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ABC-ELISA)對外周血TNF-α的含量進行檢測。探討17β-雌二醇對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用，從而為臨床防治青光眼視神經(jīng)變性提供實驗依據(jù)。
　　 方法：清潔級健康成年SD大鼠30只，雄性（盡量減少內(nèi)源性雌激素的影響），無眼疾，體重220士20g。隨機分為三組：Ⅰ組為空白對照組10只，Ⅱ組為17β-雌二醇腹腔注射組10只，Ⅲ組為消毒橄欖油腹腔注射組10只。Ⅱ、Ⅲ組均采用前房加壓灌注法將

5、左眼制成急性高眼壓模型（簡稱Ⅱ組模型眼、Ⅲ組模型眼），右眼為自身對照眼（簡稱Ⅱ組對照眼、Ⅲ組對照眼）。10％水合氯醛過量麻醉大鼠，完整取出眼球及眶內(nèi)視神經(jīng)，經(jīng)去除結膜及肌肉組織、固定、取出晶體，再固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋后切片。應用免疫組化技術分析視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡及TNF-α的表達。采用計算機圖象分析系統(tǒng)對圖象中的陽性反應部位進行半定量測定，以平均光密度值(OD)值來表示抗原表達量（注：陽性細胞表現(xiàn)為黃色或棕黃色，平均光密度值越

6、高表示抗原表達量越高）。同時抽取股靜脈血3ml凝固后離心取血清，采用ABC-ELISA法測定TNF-α的含量。實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為顯著性差異，結果用均數(shù)士標準差(Meαn±SD)表示。
　　 結果：1視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞HE染色Ⅰ組大鼠視網(wǎng)膜HE染色可見神經(jīng)節(jié)細胞層細胞大小相似，輪廓規(guī)則，核深染，細胞邊界清晰；Ⅱ組模型眼神經(jīng)節(jié)細胞層細胞大小不一，輪廓不規(guī)則，核深染，細胞邊界清晰。Ⅲ組模

7、型眼可見神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目明顯減少，神經(jīng)節(jié)細胞層呈空泡樣改變，部分細胞出現(xiàn)核溶解、核染色淺淡。Ⅱ組、Ⅲ組對照眼神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少，形態(tài)大致正常。2視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免疫組化染色（Thy-1.1是大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的特異性標志，本實驗采用小鼠抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體作為一抗，進行免疫組化染色）
　　 Ⅰ組平均光密度值：0.1944±0.0202;Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1265士0.0128，Ⅱ組對照眼平均光密度值：0.14

8、80士0.0107;Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.0533±0.0117，Ⅲ組對照眼平均光密度值：0.1019士0.0182。Ⅰ組呈Thy-1.1強陽性染色，其平均光密度值高于Ⅱ、Ⅲ組模型眼及對照眼且均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼染色強度高于Ⅲ組模型眼，且平均光密度值有統(tǒng)計學意義P＜0，05)。Ⅱ、Ⅲ組模型眼陽性染色強度低于自身對照眼，平均光密度值有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗結果判定：陽性反應細胞呈黃色或棕黃色。3視網(wǎng)膜

9、神經(jīng)節(jié)細胞TUNEL原位凋亡TUNEL染色陽性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在三組動物眼球的切片上均可檢測到，Ⅰ組及Ⅱ、Ⅲ組的對照眼TUNEL染色陽性強度最弱，陽性細胞比較零散，細胞核多呈圓形、橢圓形，染色較淺。Ⅱ、Ⅲ組模型眼TUNEL陽性染色較強。Ⅰ組平均光密度值：0.0557士0.0118。Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1079士0.0183，Ⅱ組對照眼平均光密度值：0.0878±0.0818。Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.2335士0.0128，

10、Ⅲ組對照眼平均光密度值：0.1147士0.0204。Ⅱ、Ⅲ組模型眼平均光密度值高于自身對照眼，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼、Ⅲ組對照眼之間平均光密度值無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。實驗結果判定：陽性反應細胞核呈黃色或棕黃色。
　　 4視網(wǎng)膜TNF-α免疫組化染色視網(wǎng)膜各層均可見陽性染色，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞屢最多見。Ⅰ組平均光密度值：0.5525士0.0116。Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1470士0.0233，Ⅱ

11、組對照眼平均光密度值：0.0776士0.1024。Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.1953士0.0175，Ⅲ組對照眼平均光密度值：0.1327士0，0166。Ⅱ、Ⅲ組模型眼呈TNF-α強陽性染色，其平均光密度值高于自身對照眼及Ⅰ組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組的模型眼及對照眼TNF-α平均光密度值高于空白組有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。Ⅱ組模型眼TNF-α平均光密度值低于Ⅲ組模型眼有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼、Ⅲ組對照

12、眼平均光密度值無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)實驗結果判定：陽性反應細胞呈黃色或棕黃色。
　　 5ABC-ELISA法測定外周血TNF-α含量Ⅰ組TNF-α含量：12.89士1.86pg/ml。Ⅱ組TNF-α含量：23.76士2.34pg/ml。Ⅲ組TNF-α:40.58士3.87pg/ml。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組外周血血清TNF-α濃度兩兩間均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6兩變量之間的相關性分析視網(wǎng)膜中TNF-α的

13、表達與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Thy-1.1的表達負相關，相關系數(shù)為-0.897(p＜0.01)。視網(wǎng)膜中TNF-α的表達與視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞TUNEL的表達正相關，相關系數(shù)為0.851(p＜0.01)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞Thy-1.1的表達與TUNEL的表達負相關，相關系數(shù)為-0.865(p＜0.01)。
　　 結論：117-β雌二醇可減少急性高眼壓作用下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡，對視神經(jīng)有保護作用。
　　 2前房灌注造成的急