17-β雌二醇對(duì)高眼壓視神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：青光眼(glaucoma)是一組以視神經(jīng)凹陷性萎縮和視野缺損為共同特征的不可逆性致盲性眼病，其病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性凋亡。傳統(tǒng)的機(jī)械學(xué)說(shuō)和缺血學(xué)說(shuō)并不能完全解釋青光眼神經(jīng)退變機(jī)理。流行病學(xué)顯示閉角型青光眼(primaryangle-closureglaucoma，PACG)女性發(fā)病率約為男性的2～4倍，發(fā)病年齡多在50歲以上。而在原發(fā)性開(kāi)角型青光眼(primaryopen-angleglaucoma,POAG)男性發(fā)病

2、率明顯高于女性，50歲以后差距變小。這種性別差異是否提示青光眼和性激素的水平之間存在一定的關(guān)系?近年研究表明，雌激素對(duì)受損的神經(jīng)元，雌激素可以通過(guò)減少小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG)氮氧化合物的表達(dá)和過(guò)氧化物的釋放，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用等方面起到有效的神經(jīng)保護(hù)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜中最具代表性的免疫細(xì)胞。近年諸多學(xué)者認(rèn)識(shí)到免疫學(xué)因素尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞參與了青光眼視神經(jīng)病變的病理生理過(guò)程?；罨蟮男∧z質(zhì)細(xì)胞對(duì)視神經(jīng)具有一定的保護(hù)

3、作用，但其分泌產(chǎn)物如腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)α等卻與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于雌激素對(duì)高眼壓作用下的視神經(jīng)是否具有保護(hù)作用及對(duì)TNF-α含量的影響未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用前房加壓灌注法制成急性高眼壓模型，并加以17β-雌二醇(17-βestrαdiol，17βE2)腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)和免疫組化技術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和TNF-α的表達(dá)進(jìn)行半定量

4、測(cè)定，并應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ABC-ELISA)對(duì)外周血TNF-α的含量進(jìn)行檢測(cè)。探討17β-雌二醇對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用，從而為臨床防治青光眼視神經(jīng)變性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：清潔級(jí)健康成年SD大鼠30只，雄性（盡量減少內(nèi)源性雌激素的影響），無(wú)眼疾，體重220士20g。隨機(jī)分為三組：Ⅰ組為空白對(duì)照組10只，Ⅱ組為17β-雌二醇腹腔注射組10只，Ⅲ組為消毒橄欖油腹腔注射組10只。Ⅱ、Ⅲ組均采用前房加壓灌注法將

5、左眼制成急性高眼壓模型（簡(jiǎn)稱(chēng)Ⅱ組模型眼、Ⅲ組模型眼），右眼為自身對(duì)照眼（簡(jiǎn)稱(chēng)Ⅱ組對(duì)照眼、Ⅲ組對(duì)照眼）。10％水合氯醛過(guò)量麻醉大鼠，完整取出眼球及眶內(nèi)視神經(jīng)，經(jīng)去除結(jié)膜及肌肉組織、固定、取出晶體，再固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋后切片。應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡及TNF-α的表達(dá)。采用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)對(duì)圖象中的陽(yáng)性反應(yīng)部位進(jìn)行半定量測(cè)定，以平均光密度值(OD)值來(lái)表示抗原表達(dá)量（注：陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為黃色或棕黃色，平均光密度值越

6、高表示抗原表達(dá)量越高）。同時(shí)抽取股靜脈血3ml凝固后離心取血清，采用ABC-ELISA法測(cè)定TNF-α的含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為顯著性差異，結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Meαn±SD)表示。
　　 結(jié)果：1視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞HE染色Ⅰ組大鼠視網(wǎng)膜HE染色可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞大小相似，輪廓規(guī)則，核深染，細(xì)胞邊界清晰；Ⅱ組模型眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞大小不一，輪廓不規(guī)則，核深染，細(xì)胞邊界清晰。Ⅲ組模

7、型眼可見(jiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈空泡樣改變，部分細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、核染色淺淡。Ⅱ組、Ⅲ組對(duì)照眼神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，形態(tài)大致正常。2視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免疫組化染色（Thy-1.1是大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的特異性標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體作為一抗，進(jìn)行免疫組化染色）
　　 Ⅰ組平均光密度值：0.1944±0.0202;Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1265士0.0128，Ⅱ組對(duì)照眼平均光密度值：0.14

8、80士0.0107;Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.0533±0.0117，Ⅲ組對(duì)照眼平均光密度值：0.1019士0.0182。Ⅰ組呈Thy-1.1強(qiáng)陽(yáng)性染色，其平均光密度值高于Ⅱ、Ⅲ組模型眼及對(duì)照眼且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼染色強(qiáng)度高于Ⅲ組模型眼，且平均光密度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0，05)。Ⅱ、Ⅲ組模型眼陽(yáng)性染色強(qiáng)度低于自身對(duì)照眼，平均光密度值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈黃色或棕黃色。3視網(wǎng)膜

9、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TUNEL原位凋亡TUNEL染色陽(yáng)性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在三組動(dòng)物眼球的切片上均可檢測(cè)到，Ⅰ組及Ⅱ、Ⅲ組的對(duì)照眼TUNEL染色陽(yáng)性強(qiáng)度最弱，陽(yáng)性細(xì)胞比較零散，細(xì)胞核多呈圓形、橢圓形，染色較淺。Ⅱ、Ⅲ組模型眼TUNEL陽(yáng)性染色較強(qiáng)。Ⅰ組平均光密度值：0.0557士0.0118。Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1079士0.0183，Ⅱ組對(duì)照眼平均光密度值：0.0878±0.0818。Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.2335士0.0128，

10、Ⅲ組對(duì)照眼平均光密度值：0.1147士0.0204。Ⅱ、Ⅲ組模型眼平均光密度值高于自身對(duì)照眼，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼、Ⅲ組對(duì)照眼之間平均光密度值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞核呈黃色或棕黃色。
　　 4視網(wǎng)膜TNF-α免疫組化染色視網(wǎng)膜各層均可見(jiàn)陽(yáng)性染色，以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞屢最多見(jiàn)。Ⅰ組平均光密度值：0.5525士0.0116。Ⅱ組模型眼平均光密度值：0.1470士0.0233，Ⅱ

11、組對(duì)照眼平均光密度值：0.0776士0.1024。Ⅲ組模型眼平均光密度值：0.1953士0.0175，Ⅲ組對(duì)照眼平均光密度值：0.1327士0，0166。Ⅱ、Ⅲ組模型眼呈TNF-α強(qiáng)陽(yáng)性染色，其平均光密度值高于自身對(duì)照眼及Ⅰ組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ組、Ⅲ組的模型眼及對(duì)照眼TNF-α平均光密度值高于空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。Ⅱ組模型眼TNF-α平均光密度值低于Ⅲ組模型眼有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ⅱ組模型眼、Ⅲ組對(duì)照

12、眼平均光密度值無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞呈黃色或棕黃色。
　　 5ABC-ELISA法測(cè)定外周血TNF-α含量Ⅰ組TNF-α含量：12.89士1.86pg/ml。Ⅱ組TNF-α含量：23.76士2.34pg/ml。Ⅲ組TNF-α:40.58士3.87pg/ml。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組外周血血清TNF-α濃度兩兩間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6兩變量之間的相關(guān)性分析視網(wǎng)膜中TNF-α的

13、表達(dá)與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Thy-1.1的表達(dá)負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.897(p＜0.01)。視網(wǎng)膜中TNF-α的表達(dá)與視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TUNEL的表達(dá)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.851(p＜0.01)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Thy-1.1的表達(dá)與TUNEL的表達(dá)負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.865(p＜0.01)。
　　 結(jié)論：117-β雌二醇可減少急性高眼壓作用下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，對(duì)視神經(jīng)有保護(hù)作用。
　　 2前房灌注造成的急