胚胎干細胞基因在晶狀體上皮中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的分化表達.pdf

1、在整個生命過程中，晶狀體上皮細胞(Lens epithelial cells，LECs)幾乎都在持續(xù)進行分裂，其子細胞不斷從晶狀體的生殖區(qū)遷移到赤道區(qū)、延伸，最后分化為晶狀體纖維。我們以前的研究表明在兔晶狀體中央?yún)^(qū)上皮細胞中可能存在晶狀體干細胞，故本研究目的之一是進一步證實我們之前的結論。因此，作者以6月齡以下家兔為實驗材料，分離其晶狀體中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)上皮細胞，并分別將其用于體外原代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的細胞經RT-PCR和細胞免疫熒光技術分

2、析，其主要結果如下：
　　 1、不同區(qū)域的晶狀體上皮細胞均能在體外培養(yǎng)成功；
　　 2、RT-PCR和細胞免疫熒光結果均表明胚胎干細胞基因CD9和SOX2在原代培養(yǎng)的晶狀體中央?yún)^(qū)上皮細胞中表達比在周邊區(qū)明顯強烈，差異顯著。此結果進一步支持了晶狀體中央?yún)^(qū)可能存在晶狀體干細胞這一推論。
　　 另一方面，眾所周知晶狀體上皮細胞是通過一個自我消除其細胞器等一系列過程而分化為晶狀體纖維。而脫氧核糖核酸限制性內切酶DLAD(

3、DNaseⅡ-like acid DNase，似二型脫氧核糖核酸酶)在晶狀體上皮細胞的分化過程中對晶狀體纖維的去核化起重要作用。編碼DLAD蛋白的基因已被克隆，可是當時市場上尚無DLAD抗體出售，因此妨礙了對DLAD的功能進行研究。為使后續(xù)實驗能順利展開，本論文的另一部分內容則為準備用于研究晶狀體上皮細胞分化的抗體——小鼠DLAD(mouse DLAD，mDLAD)多克隆抗體。為此，我首先制備并純化了一種本實驗室正積極研究的在脊椎動物眼

4、睛和其它組織中起重要作用的蛋白——絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A催化亞基β(PP-2Acβ)的GST融合蛋白。以此融合蛋白為抗原，成功制備了識別視網(wǎng)膜色素上皮細胞(ARPE)中內源性PP-2A的抗血清。在此成功制備抗體的經驗基礎上，我積極準備制備DLAD多克隆抗體。然而，通過一系列研究我發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術和方法幾乎不可能在原核中誘導表達mDLAD基因。其中部分原因可能為DLAD編碼的是一核酸內切酶，外源性表達該酶其可能會降解宿主DNA，因此宿主通過