乙型肝炎病毒X蛋白反式調(diào)節(jié)基因11剪切體的克隆表達(dá)和功能研究.pdf

1、研究背景與目的：我國是乙型肝炎與肝癌的高發(fā)區(qū)。乙型肝炎病毒（HBV）X基因及其編碼的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)錄的必須因子，與乙型肝炎和肝細(xì)胞癌的發(fā)生關(guān)系十分密切。本研究通過寡核苷酸基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析確定了HBxAg反式激活作用的新型靶基因，即乙型肝炎病毒X蛋白反式調(diào)節(jié)基因11（XTP11）。本研究在探討XTP11的生物學(xué)功能過程中，發(fā)現(xiàn)XTP11的剪切體；通過生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、原核表達(dá)幾個(gè)方面初步闡釋該基

2、因剪切體在HBV發(fā)病過程中的生物學(xué)作用。 方法： （1）根據(jù)XTP11的全長編碼基因，設(shè)計(jì)克隆擴(kuò)增得到XTP11剪切體，對剪切體進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 （2）構(gòu)建重組綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C1-XTP11剪切體，轉(zhuǎn)染人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2，轉(zhuǎn)染24hr后在熒光倒置顯微鏡下觀察。 （3）構(gòu)建重組的原核表達(dá)載體pET-32a（+）-XTP11剪切體轉(zhuǎn)化BL21宿主菌后，重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得了

3、帶有組氨酸（His-）標(biāo)簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達(dá)，并用SDS-PAGE和Western blot對表達(dá)蛋白的特異性進(jìn)行分析和驗(yàn)證；利用Ni+親和柱純化表達(dá)蛋白。 結(jié)果： （1）利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTn比對分析XTP11基因，根據(jù)基因起始密碼子的Kozak規(guī)則和終止密碼子下游保守的多聚腺苷酸信號序列，電子拼接推定該基因的開放讀碼框架，獲得相應(yīng)的XTP11剪切體全長編碼基因。在NCBI中登陸獲取基因庫登錄號（FJ2

4、11061）。研究發(fā)現(xiàn)XTP11剪切體（1314bp）比XTP11（1344bp）少了GGGDFGGGDF 10個(gè)氨基酸殘基，其余序列相同。 （2）HepG2細(xì)胞漿出現(xiàn)均勻綠色熒光信號，提示XTP11剪切體主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)。 （3）XTP11剪切體融合蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)。SDS-PAGE分析表明其以包涵體形式存在，Western blot檢測目的基因表達(dá)蛋白的特異性，成功獲得了融合蛋白純品。 結(jié)論：本研

5、究利用ProtParam軟件的分析，發(fā)現(xiàn)了XTP11剪切體蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性指數(shù)和總平均親水性。該蛋白主要有轉(zhuǎn)角和折疊組成，較少涉及螺旋和無規(guī)卷曲。該蛋白質(zhì)疏水性值的變化范圍為：-0.322-2.267； Signa1P3.0-信號肽預(yù)測工具分析錨定蛋白概率為0.195，提示該蛋白為非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位證實(shí)XTP11剪切體基因定位于肝細(xì)胞漿內(nèi)。本研究成功利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白通過親和層析技術(shù)進(jìn)行了