白藜蘆醇對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌ARHI表達(dá)和STAT3信號(hào)通路活化的雙向調(diào)控作用.pdf

1、目的:
　　非黑色素瘤皮膚癌(NMSC)是一類(lèi)最常見(jiàn)的皮膚癌，據(jù)估算NMSC約占全世界每年確診的所有惡性腫瘤的1/3，患者數(shù)量龐大，嚴(yán)重危害公眾健康。最常見(jiàn)的NMSC是皮膚基底細(xì)胞癌(Basal Cell Carcinoma，BCC)和鱗狀細(xì)胞癌(SquamousCell Carcinoma，SCC)。在我國(guó)，皮膚SCC的發(fā)病率比例要比BCC高。通常皮膚SCC可以通過(guò)手術(shù)和/或放射治療，但是具有一定的復(fù)發(fā)可能性，甚至導(dǎo)致淋巴管浸潤(rùn)

2、以及遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移。對(duì)于老年人、存在手術(shù)危險(xiǎn)因素和相對(duì)年輕病灶位于美容敏感區(qū)域的患者，需要一個(gè)理想的化療藥物的替代方案，發(fā)掘有效的生物制劑具有現(xiàn)實(shí)的腫瘤治療意義。
　　白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種天然多酚類(lèi)化合物，存在于一些植物和草藥中，如葡萄，花生和虎杖等，具有抗氧化、心臟保護(hù)以及預(yù)防和抑制腫瘤的作用。白藜蘆醇與腫瘤生成的細(xì)胞信號(hào)通路如p53、STAT3、ERK1/2等密切相關(guān)，由此提示，白藜蘆醇極有可能成為皮膚癌

3、臨床治療中的理想候選藥物，但在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，其具體作用的信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，開(kāi)展白藜蘆醇對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的研究十分重要。
　　ARHⅠ基因(aplysia ras homologⅠ)是一個(gè)母系印記抑癌基因，在多種癌癥中抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，增殖和侵襲，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。ARHⅠ參與多條信號(hào)通路的相關(guān)調(diào)控，其中之一是調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)信號(hào)通路，防止磷酸化的STAT3核易位到細(xì)胞核中誘導(dǎo)基因表達(dá)，

4、抑制細(xì)胞增殖和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)在皮膚SCC中磷酸化STAT3的表達(dá)比正常皮膚多，磷酸化STAT3的過(guò)度表達(dá)可能在表皮腫瘤的發(fā)展中起重要作用，而ARHⅠ在皮膚SCC的表達(dá)情況鮮見(jiàn)報(bào)道。因此綜上所述，探究在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中ARHⅠ的表達(dá)情況，白藜蘆醇、ARHⅠ和STAT3信號(hào)通路三者在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的聯(lián)系，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的研究，及白藜蘆醇治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌的策略選擇提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　84例皮膚癌及74

5、例正常癌旁組織的標(biāo)本由大連皮膚病醫(yī)院提供，實(shí)驗(yàn)所用的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13來(lái)自于大連市皮膚病醫(yī)院劉之力教授的饋贈(zèng)。人永生化角質(zhì)細(xì)胞系HaCat由德國(guó)遺傳學(xué)研究所MartinHofman博士提供。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)石蠟組織微陣列技術(shù)以及免疫組織化學(xué)染色分析ARHⅠ在正常皮膚組織與皮膚癌組織的表達(dá)差異。采用MTT分析和流式細(xì)胞儀技術(shù)觀察各細(xì)胞系對(duì)白藜蘆醇敏感性的差異。通過(guò)RT-PCR、Western

6、印跡雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析，檢測(cè)白藜蘆醇處理前后各細(xì)胞系中ARHⅠ、STAT3信號(hào)通路的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平的變化。利用免疫熒光染色，觀察白藜蘆醇處理前后ARHⅠ與STAT3在各細(xì)胞系中的定位表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.ARHⅠ在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著低表達(dá)于正常皮膚組織，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＜0.05。
　　2.各細(xì)胞系對(duì)白藜蘆醇敏感性的研究
　　2.1 MTT分析結(jié)果表明白藜蘆醇抑制各細(xì)胞系的細(xì)胞

7、增殖。
　　2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明白藜蘆醇處理之后細(xì)胞系Colo16、SCC-1和SCC-13發(fā)生G1期阻滯。
　　3.RT-PCR方法檢測(cè)分析。在白藜蘆醇處理之后，ARHⅠ在各細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)均有所升高，但STAT3的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，我們檢測(cè)了一些STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，survivin在細(xì)胞系Colo16、 SCC-1、SCC-12和SCC-13中均發(fā)生了mR

8、NA表達(dá)下調(diào)，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化;VEGF在細(xì)胞系HaCaT、SCC-12和SCC-13中mRNA表達(dá)下調(diào)，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化;c-Myc只有在Colo16細(xì)胞系中發(fā)生mRNA表達(dá)下調(diào)，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化;cyclinD1在各細(xì)胞系中mRNA表達(dá)均無(wú)明顯變化。
　　4.Western印跡雜交分析和免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析。結(jié)果表明，在白藜蘆醇處理之后，在各個(gè)細(xì)胞系中ARHⅠ的蛋白表達(dá)均有所升高，STAT3的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化，

9、survivin在細(xì)胞系SCC-12和SCC-13中蛋白的表達(dá)下降，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化;VEGF在各細(xì)胞系中蛋白的表達(dá)都下降，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化;c-Myc在細(xì)胞系HaCaT中發(fā)生蛋白的表達(dá)下降，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化，cyclinD1在細(xì)胞系HaCaT、Colo16和SCC-13中蛋白的表達(dá)下降，其他細(xì)胞系無(wú)明顯變化。
　　5.細(xì)胞免疫熒光技術(shù)分析。結(jié)果表明在白藜蘆醇作用之后，ARHⅠ與STAT3在核周?chē)黠@聚集，可能抑制ST

10、AT3的入核。
　　結(jié)論:
　　1.抑癌基因ARHⅠ在正常鱗狀上皮組織中是高表達(dá)的，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中是低表達(dá)的。
　　2.白藜蘆醇可有效的抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13的細(xì)胞增殖，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。
　　3.白藜蘆醇可促進(jìn)人類(lèi)永生化表皮細(xì)胞系HaCaT和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Colo16、SCC-1、SCC-12、SCC-13的抑癌基因ARHⅠ的表達(dá)，降低ST