IL-17A介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及調(diào)控Act1-IRF-1信號(hào)通路在POCD形成的機(jī)制研究.pdf

1、術(shù)后認(rèn)知功能障礙（Postoperative cognitive dysfunction, POCD）是病人術(shù)后出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要并發(fā)癥之一，主要以老年或危重病人高發(fā)。高齡和危重手術(shù)是被認(rèn)為是 POCD高危因素。然迄今為止，POCD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。中樞炎癥反應(yīng)是多種退行性疾病的主要特征，包括多發(fā)性硬化，阿爾茲海病，帕金森氏病，POCD等。隨著患者年齡的增長(zhǎng)或外周的刺激，老年病人或危重患者中樞處于輕度的慢性炎癥微環(huán)境。手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)

2、致中樞神經(jīng)炎癥免疫動(dòng)態(tài)失衡。一定的手術(shù)創(chuàng)傷刺激可激發(fā)中樞神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞活化，維持中樞炎癥免疫平衡，從而保護(hù)神經(jīng)元；但對(duì)老年患者或危重患者，一定手術(shù)創(chuàng)傷可激發(fā)外周和中樞炎癥免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，大量釋放炎癥介質(zhì)，發(fā)展成為持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，致中樞炎癥免疫動(dòng)態(tài)失衡，產(chǎn)生如 POCD一系列并發(fā)癥。星形膠質(zhì)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞，參與血腦屏障的組成，可直接收到來(lái)自外周免疫細(xì)胞和炎癥因子激活；同時(shí)也是

3、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性細(xì)胞因子和趨化因子的重要來(lái)源。IL-17A可介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。在1993年證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá) IL-17RA受體。發(fā)現(xiàn)IL-17A對(duì)CNS的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有深刻的影響，特別是在缺血，炎癥和退行性變疾病。目前已經(jīng)證實(shí) IL-17RA在人類和鼠類的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)。Act1/IRF-1信號(hào)通路在中樞炎癥免疫反應(yīng)起著重要作用，參與調(diào)控炎癥反應(yīng)。由此，我們提出假說(shuō)：在POCD中，手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的外源性的IL-17

4、A作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上的IL-17RA,通過(guò)Act1/IRF-1信號(hào)通路調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化、釋放炎癥因子和趨化因子，形成過(guò)度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致POCD的形成。
　　第一部分：IL-17A對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：觀察IL-17A在TFS后的表達(dá)變化和和給予IL-17A抗體(Abs)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響和術(shù)后認(rèn)知的影響；
　　方法：建立小鼠TFS模型，模擬手術(shù)環(huán)境，觀察IL-17A在POCD中的表

5、達(dá)變化,給予Abs對(duì)中樞炎癥、星形膠質(zhì)細(xì)胞和術(shù)后認(rèn)知的影響；通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察不同濃度的IL-17A對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化的影響。采用ELISA測(cè)量血清，海馬組織IL-17A值；采用TFC（場(chǎng)景條件恐懼記憶實(shí)驗(yàn)）和Y-maze（Y型迷宮）測(cè)試認(rèn)知功能改變；RT-qPCR測(cè)量炎癥因子（Il6, Tnfα,Il1β），趨化因子（Ccl2, Ccl5,Cxcl10）和Gfap基因的表達(dá)；免疫組化監(jiān)測(cè)星形膠質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞在CA1和C

6、A3區(qū)的表達(dá)；免疫熒光和Western Blotting監(jiān)測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)果:ELISA顯示血清和海馬組織IL-17A在TFS后6h,12h,24h,48h時(shí)顯著增加；并于TFS后12h達(dá)到高峰，一直持續(xù)至術(shù)后48h；單純手術(shù)小鼠的CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化；海馬區(qū)炎癥因子（Il6, Tnfα,Il1β），趨化因子（Ccl2, Ccl5,Cxcl10）和Gfap基因表達(dá)顯著增加；T

7、FC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減少和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著增加；給予Abs后，CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化減少；顯著的降低海馬區(qū)炎癥因子（Il6, Tnfα,Il1β），趨化因子（Ccl2, Ccl5,Cxcl10）和Gfap基因表達(dá)減低；小鼠的CA1和CA3區(qū)陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞減少；TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減低和 Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著提高。離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn) IL-17A劑量的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

8、顯著增強(qiáng)，呈量效關(guān)系。
　　結(jié)論：手術(shù)可導(dǎo)致IL-17A分泌顯著增加，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活中樞炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙；給予Abs，可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活性，抑制中樞炎癥反應(yīng)，改善術(shù)后認(rèn)知。
　　第二部分：IL-17A通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控術(shù)后認(rèn)知功能
　　目的：觀察IL-17A是否通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控術(shù)后認(rèn)知功能。
　　方法：通過(guò)培育GFAPTK F1小鼠，給予工具藥GCV和外源性IL-17A，鑒定GC

9、V是否完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞；均采用GFAPTK F1小鼠，隨即分為四組：Control組，GCV組，IL-17A組和GCV+IL-17A組，后三組均建立TFS模型。ELISA法測(cè)定血清IL-17A值；采用TFC和Y-maze測(cè)試認(rèn)知功能改變；免疫熒光確認(rèn)GFAPTK+GCV是否完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞；監(jiān)測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。
　　結(jié)果：GFAPTK小鼠給予GCV后完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化；外源性IL-17A顯著的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞

10、；血清IL-17A濃度增加；TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著減少和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著增加；通過(guò)GCV完全抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后，雖外源性IL-17A增加；但TFC的僵住反應(yīng)時(shí)間顯著增加和Y-maze跑至安全區(qū)域次數(shù)顯著減少。
　　結(jié)論：外源性IL-17A可顯著的激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞后， IL-17A并不能增加中樞炎癥反應(yīng)；因此，IL-17A首先作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)控炎癥反應(yīng)，影響認(rèn)知。
　　第三部分：IL

11、-17A介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Act1/IRF-1通路導(dǎo)致POCD發(fā)生
　　目的：IL-17A是否介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞Act1/IRF-1通路導(dǎo)致POCD發(fā)生
　　方法：通過(guò)上述兩部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Western Blotting法測(cè)定第一部分各組海馬組織Act1，TRAF6，NF-κB(p65)和IRF-1蛋白；免疫熒光法測(cè)第二部分各組海馬組織Act1和PSD95的表達(dá)；
　　結(jié)果:手術(shù)后，海馬組織Act1，TRAF6，N