丙戊酸鈉對NK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞的易化作業(yè)及機(jī)制.pdf

1、目的：探討丙戊酸鈉能否易化NK細(xì)胞對普通胰腺癌細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞樣胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用；研究丙戊酸鈉對上述胰腺癌細(xì)胞表面MICA/B分子表達(dá)的影響，并驗證其是否為丙戊酸鈉易化NK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞的主要機(jī)制；深入研究丙戊酸鈉調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞MICA/B分子表達(dá)的分子機(jī)制；探討丙戊酸鈉在體內(nèi)對胰腺癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響，檢驗丙戊酸鈉在體內(nèi)能否易化NK細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞的殺傷。
　　方法：以胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、BxPC-3、MI

2、A-Paca-2為研究對象，用干細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基選擇性增殖腫瘤干細(xì)胞樣胰腺癌細(xì)胞，與普通胰腺癌細(xì)胞一起作為靶細(xì)胞。以 NK細(xì)胞系NK-92作為效應(yīng)細(xì)胞，采用乳酸脫氫酶釋放法檢測NK細(xì)胞對丙戊酸鈉孵育前后靶細(xì)胞的殺傷能力；用抗體封閉NK細(xì)胞表面NKG2D受體，再次檢測NK-92細(xì)胞對各種靶細(xì)胞的殺傷能力。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR)以及流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry)分別測定丙戊酸鈉孵育前后各種細(xì)胞內(nèi)MICA/

3、B mRNA以及細(xì)胞表面MICA/B蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR檢測丙戊酸鈉處理前后HER2、HER3、ATM、ATR以及PI3K mRNA的表達(dá)水平，并以蛋白免疫印跡（western blotting)法檢測Akt表達(dá)水平及磷酸化水平。以HER2/HER3抑制劑lapatinib或PI3K/Akt抑制劑LY294002或ATM/ATR抑制劑Caffeine與丙戊酸鈉一起孵育胰腺癌細(xì)胞，qRT-PCR以及How cytometry分別

4、測定孵育前后各種細(xì)胞內(nèi)MICA/B mRNA以及細(xì)胞表面MICA/B蛋白的表達(dá)水平。針對PI3KCA的mRNA序列設(shè)計3個干擾序列以及陰性、陽性對照序列，用丨ipo2000轉(zhuǎn)染PANC-1以及BxPC-3細(xì)胞，qRT-PCR和western blotting檢測PI3KCA mRNA和蛋白的被抑制情況；選取干擾效果較好的2個序列轉(zhuǎn)染PANC-1以及BxPC-3細(xì)胞，qRT-PCR以及Flow cytometry分別檢測丙戊酸鈉孵育前后轉(zhuǎn)

5、染細(xì)胞內(nèi)MICA/B mRNA以及細(xì)胞表面MICA/B蛋白的表達(dá)水平，乳酸脫氫酶釋放法檢測丙戊酸鈉后NK細(xì)胞對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的殺傷能力。造荷胰腺癌NOD/SCID小鼠模型，以其為對象檢驗單用NK-92細(xì)胞或聯(lián)用丙戊酸鈉與NK-92細(xì)胞的治療效果，并聯(lián)用PI3K/Akt抑制劑LY294002，驗證丙戊酸鈉在體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制；免疫組織化學(xué)染色檢測各組小鼠腫瘤MICA/B的表達(dá)。
　　結(jié)果：乳酸脫氫酶釋放試驗結(jié)果顯示在效靶比為10:1時NK

6、-92細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、BxPC-3、MIA-Paca-2在丙戊酸鈉孵育前后的殺傷率分別為36.11％±8.29％和52.22％±3.22％、26.88％±4.09％和46.11％±8.29％、21.88％±4.09％和43.81％±4.96％，丙戊酸鈉孵育后NK-92細(xì)胞對普通胰腺癌細(xì)胞的殺傷率顯著提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。三株胰腺癌細(xì)胞系中僅有PANC-1和MIA-Paca-2能夠在干細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基中形成腫瘤干細(xì)胞

7、樣細(xì)胞球。乳酸脫氫酶釋放試驗結(jié)果顯示丙戊酸鈉孵育后，NK-92細(xì)胞在E:T為10時對腫瘤干細(xì)胞樣PANC-1細(xì)胞的殺傷率由24.42％±3.38％提高到40.32％±2.50％，對MIA-Paca-2細(xì)胞由18.23％±3.38％提高到32.55％±6.43％，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。為了探討丙戊酸鈉發(fā)揮上述作用的機(jī)制，我們檢測了丙戊酸鈉對胰腺癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響。qRT-PCR以及Flow cytometry試驗結(jié)果顯示，丙戊酸

8、鈉孵育后胰腺癌細(xì)胞PANC-1、BxPC-3、MIA-Paca-2內(nèi)MICA和MICB mRNA分子以及細(xì)胞表面MICA/B蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)，腫瘤干細(xì)胞樣PANC-1、MIA-Paca-2細(xì)胞的MICA和MICB mRNA分子以及MICA/B蛋白的表達(dá)也明顯上調(diào)，說明丙戊酸鈉可能通過上調(diào)MICA/B的表達(dá)發(fā)揮易化NK細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞。為了驗證以上結(jié)論，我們以抗NKG2D抗體封閉過的NK-92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行乳酸脫氫酶釋放試驗，

9、結(jié)果顯示封閉NKG2D受體后，丙戊酸納不能有效地提尚NK-92細(xì)胞對膜腺癌細(xì)胞的殺傷能力。為了進(jìn)一步探討丙戊酸鈉上調(diào)MICA/B表達(dá)的分子機(jī)制，我們采用qRT-PCR檢測了丙戊酸鈉對HER2/HER3、PI3K/Akt以及ATM/ATR通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙戊酸鈉孵育后胰腺癌細(xì)胞PANC-1的HER2、ATM以及ATR mRNA的表達(dá)均顯著下降，而HER3、PI3KCA mRNA的表達(dá)有顯著地提高；BxPC-3以及MIA-Paca-2細(xì)

10、胞的HER2 mRNA的表達(dá)量顯著下降， HER3、PI3KCA mRNA的表達(dá)均有顯著地提高，而ATM以及ATR mRNA的表達(dá)量未見明顯改變。western blotting結(jié)果顯不丙戊酸鈉孵育以后PANC-1、BxPC-3、MIA-Paca-2細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)水平無明顯變化，但其磷酸化水平均顯著提高。以HER2/HER3抑制劑lapatinib或PI3K/Akt抑制劑LY294002與丙戊酸鈉一起孵育胰腺癌細(xì)胞后，qRT-PCR

11、結(jié)果顯示MICA和MICB mRNA的表達(dá)均低于單用丙戊酸鈉孵育組，F(xiàn)low cytometry檢測顯示細(xì)胞表面MICA/B蛋白的表達(dá)也低于單用丙戊酸鈉組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，而ATM/ATR抑制劑Caffeine不能夠有效抑制丙戊酸鈉的作用（P>0.05)。為了進(jìn)一步驗證PI3K/Akt通路的作用，我們采用三個PI3KCA特異性的siRNA序列轉(zhuǎn)染PANC-1、BxPC-3細(xì)胞，qRT-PCR及western blotting結(jié)果提

12、示PI3KCA mRNA及蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后均被明顯抑制；選擇抑制效果較強(qiáng)的兩個siRNA序列轉(zhuǎn)染PANC-1、BxPC-3細(xì)胞，qRT-PCR以及Flow cytometry實驗結(jié)果顯示，丙戊酸鈉處理后轉(zhuǎn)染干擾序列的細(xì)胞MICA和MICB mRNA以及MICA/B蛋白的表達(dá)均顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對照的細(xì)胞；乳酸脫氫酶釋放試驗結(jié)果顯示，丙戊酸鈉聯(lián)合siRNA孵育后，NK-92細(xì)胞對干擾組細(xì)胞的殺傷能力顯著低于陰性對照組。動物實驗結(jié)果顯示，N

13、K-92細(xì)胞能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長，聯(lián)用丙戊酸鈉能夠顯著增強(qiáng)NK-92細(xì)胞抑制腫瘤的效果，而同時聯(lián)用PI3K/Akt抑制劑LY294002則會抑制NK-92細(xì)胞和丙戊酸鈉的治療效果。免疫組化結(jié)果顯示丙戊酸鈉在體內(nèi)也能夠能夠上調(diào)PANC-1、BxPC-3細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，與聯(lián)用PI3K/Akt抑制劑LY294002相比，單用丙戊酸鈉PANC-1、BxPC-3細(xì)胞MICA/B表達(dá)上調(diào)更加顯著。
　　結(jié)論：1.丙戊酸鈉在體

14、外能夠上調(diào)包括腫瘤干細(xì)胞樣胰腺癌細(xì)胞在內(nèi)的胰腺癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，并且提高NK細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。用特異性抗體封閉NK細(xì)胞表面NKG2D受體能夠顯著抑制丙戊酸鈉的這種效應(yīng)。證明丙戊酸鈉易化NK細(xì)胞對胰腺癌殺傷作用的效應(yīng)是通過上調(diào)胰腺癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)實現(xiàn)的。
　　2.HER2/HER3抑制劑lapatinib和PI3K/Akt抑制劑LY294002以及針對PI3KCA的siRNA干擾序列均能抑制丙戊酸鈉上調(diào)胰腺

15、癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的效應(yīng)，siRNA序列還能抑制丙戊酸鈉易化NK細(xì)胞對胰腺癌殺傷作用的效應(yīng)，證明丙戊酸鈉上調(diào)MICA/B的表達(dá)是通過PI3K/Akt通路實現(xiàn)的。
　　3.丙戊酸鈉在體內(nèi)能夠提高腫瘤細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，并且能夠提高NK細(xì)胞抑制腫瘤生長的作用，而PI3K/Akt抑制劑LY294002能夠抑制丙戊酸鈉的效應(yīng)，證明丙戊酸鈉在體內(nèi)能夠通過PI3K/Akt通路上調(diào)MICA/B的表達(dá)，從而易化NK細(xì)胞對胰腺癌細(xì)胞的殺傷作