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文檔簡介
1、背景和目的:
胰腺癌是目前預(yù)后最差的惡性腫瘤之一,其發(fā)生機(jī)理仍未完全明了。我們的前期研究結(jié)果表明受體關(guān)聯(lián)蛋白-80(receptor-associated protein 80,RAP80)的表達(dá)在胰腺癌發(fā)生過程中進(jìn)行性升高。RAP80是在NH2末端含有兩個(gè)泛素作用結(jié)構(gòu)域(ubiquitin-interacting motifs,UIM)的核內(nèi)蛋白,功能涉及DNA修復(fù)、(去)泛素化、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等。為明確RAP80在胰腺癌中
2、的作用,本課題檢測了人胰腺癌細(xì)胞株、人胰腺癌及癌旁組織RAP80的表達(dá);采用siRNA沉默人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的RAP80 mRNA表達(dá),檢測其對(duì)細(xì)胞生長增殖、凋亡和侵襲的作用;并對(duì)其作用的分子機(jī)制和信號(hào)進(jìn)行了初步研究。通過沉默RAP80表達(dá),檢測胰腺癌細(xì)胞株對(duì)吉西他濱化療敏感性的變化,為胰腺癌治療提供潛在靶點(diǎn)。
方法:
1.RT-PCR檢測人胰腺癌細(xì)胞RAP80 mRNA水平,免疫組化檢測組織芯片31
3、例胰腺癌和癌旁組織RAP80蛋白質(zhì)表達(dá)。
2.化學(xué)合成siRNA RAP80轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株SW1990。MTT測定細(xì)胞的生長,流式細(xì)胞儀檢測Ki-67表達(dá)水平、細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡率,平板克隆形成試驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力,transwell小室檢測細(xì)胞侵襲性。
3.Western blot檢測檢測ERα、Cyclin D1、磷酸化ERK1/2及Akt蛋白水平。RT-PCR檢測ERα mRNA水平。
4、> 4.體外培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和Capan-2,siRNA RAP80沉默其RAP80表達(dá),MTT法檢測對(duì)吉西他濱的敏感性,計(jì)算IC50;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率,RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因TRAIL、Bax、Bcl-2、Survivin表達(dá)。
結(jié)果:
1.人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、Capan-2、BxPC3、Patu-8988均表達(dá)RAP80mRNA。胰腺癌組織RAP80蛋白質(zhì)的表達(dá)顯
5、著高于癌旁(P<0.01)。
2.與陰性對(duì)照組和空白組相比,siRNA RAP80組細(xì)胞的生長增殖顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05),G1期細(xì)胞明顯增多,G2-M期細(xì)胞減少(P<0.05),Ki-67表達(dá)明顯下降(P<0.05),細(xì)胞克隆形成能力降低(P<0.05),細(xì)胞侵襲率無明顯改變(P>0.05)。
3.沉默RAP80表達(dá)在加入雌二醇(E2)的情況下,可顯著降低人胰腺癌細(xì)胞株SW1
6、990 ERα蛋白水平(P<0.01),但ERα mRNA水平無明顯改變(P>0.05);抑制RAP80表達(dá),加或不加E2對(duì)SW1990細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期無明顯影響(P>0.05)。沉默RAP80表達(dá),SW1990細(xì)胞Cyclin D1、磷酸化ERK1/2及Akt蛋白水平均無顯著改變(P>0.05)。
4.沉默RAP80表達(dá)可顯著降低吉西他濱對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990和Capan-2的IC50(P<0.05),促進(jìn)細(xì)胞
7、凋亡率(P<0.05)。RT-PCR檢測Bax mRNA水平顯著升高,Bcl-2 mRNA下降,TRAIL mRNA略微升高,Survivin無明顯改變。
結(jié)論:
1.胰腺癌組織RAP80蛋白的表達(dá)顯著升高。
2.沉默RAP80表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞株SW1990的生長增殖和克隆形成能力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,但對(duì)細(xì)胞的侵襲能力無明顯影響。RAP80對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990的作用可能與ERα、Cy
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