低氧調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體α表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位的分子機制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）因其抗炎、抑制免疫、抗休克和抗毒等藥理作用，廣泛應(yīng)用于治療各種免疫炎癥性疾病，包括哮喘、慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病。當(dāng)GC與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoids receptor，GR）結(jié)合后,其伴侶蛋白熱休克蛋白90（hot shock protein

2、90，HSP90）構(gòu)象發(fā)生改變, GRα-GC復(fù)合物與HSP90等配體成分分離，HSP90脫落，形成激素-受體復(fù)合物，GRα核易位進(jìn)入細(xì)胞核,在胞核內(nèi)與激素應(yīng)答基因啟動區(qū)的激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response elements， GRES)結(jié)合,從而導(dǎo)致相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性增強并調(diào)控激素相關(guān)基因表達(dá)，產(chǎn)生生理及藥理作用。
　　糖皮質(zhì)激素的作用包括與受體結(jié)合及GC與GR結(jié)合之后引起的核轉(zhuǎn)位過程是極其復(fù)雜的，機體

3、的功能狀態(tài)及細(xì)胞所處的微環(huán)境均可影響其作用發(fā)揮。哮喘及慢性阻塞性肺病急性發(fā)作均存在不同程度的低氧血癥，前期研究顯示低氧時間依賴性抑制肺泡上皮A549細(xì)胞GRα的表達(dá)，但其信號通路及機制不明，且低氧是否會影響GRα核轉(zhuǎn)位尚不清楚。
　　研究目的：
　　本研究建立哮喘小鼠動物模型，明確哮喘急性發(fā)作是否存在GRα的表達(dá)改變及低氧血癥。體外實驗以人肺泡上皮A549細(xì)胞為模型，觀察低氧對GRα表達(dá)及MAPK信號通路的影響，靶向干預(yù)MA

4、PK信號通路，觀察GRα表達(dá)的變化，揭示低氧抑制GR表達(dá)的可能通路。觀察低氧對TLR2信號通路及Hif-1的影響，分別靶向干預(yù)TLR2信號通路及Hif-1，檢測TLR2信號蛋白、Hif-1及GR表達(dá)的變化，揭示低氧抑制GR表達(dá)的可能通路及TLR2與Hif的內(nèi)在關(guān)系。轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的GRα質(zhì)粒入A549細(xì)胞，觀察低氧對GRα核轉(zhuǎn)位的影響。本研究旨在揭示低氧抑制GRα表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的分子機制，為激素抵抗型哮喘的靶向干預(yù)提供理論依據(jù)和治療方向。

5、
　　研究方法：
　　1.建立OVA哮喘小鼠模型，實驗分組包括正常對照組，哮喘組，TLR2-/-哮喘組，免疫組化方法及Western Blot檢測GRα及Hif-1蛋白表達(dá)的變化。
　　2.低氧培養(yǎng)A549細(xì)胞人肺泡上皮A549細(xì)胞放入普通培養(yǎng)箱（37℃，95％空氣，5%CO2），給予化學(xué)性低氧條件（COCL2，1200umol/L）培養(yǎng)0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h。
　　3.Western Bl

6、ot法檢測低氧對各組細(xì)胞GRα、Hif-1、TLR2及MAPK信號家族包括磷酸化cJNK、ERK，p38表達(dá)的影響；靶向干預(yù)MAPK信號通路蛋白，觀察GRα表達(dá)的變化；轉(zhuǎn)染Hif-1及TLR2siRNA質(zhì)粒對之進(jìn)行特異性干擾，檢測MAPK信號通路蛋白及GRα的改變。
　　5.以脂磷壁酸激活TLR2通路蛋白，觀察TLR2信號通路激活狀態(tài)下GRα、Hif-1及TLR2表達(dá)的變化；
　　6.將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶綠色熒光標(biāo)記的GFP

7、-GRα質(zhì)粒，運用活細(xì)胞動態(tài)工作站動態(tài)觀察常氧及化學(xué)性低氧狀態(tài)下糖皮質(zhì)激素誘發(fā)GRα入核的時間及程度的變化。7.免疫共沉淀法檢測低氧對GR-HSP90二聚體解離的影響。
　　8.統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，每部分實驗均獨立進(jìn)行3次完成。多組間差異采用one-way ANOVA方法分析，兩組之間差異采用獨立樣本t檢驗，采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：

8、　　1.野生型哮喘小鼠肺組織中Hif-1表達(dá)顯著增強，GRα的表達(dá)下降，
　　免疫組化的結(jié)果顯示哮喘小鼠模型肺組織Hif-1陽性表達(dá)的細(xì)胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織細(xì)胞，IOD值高于正常對照組；GRα陽性表達(dá)細(xì)胞比率顯著低于正常組小鼠，IOD值低于正常對照組，上述結(jié)果提示哮喘小鼠肺組織較之正常小鼠肺組織存在低氧狀態(tài)，并且GRα表達(dá)顯著下降。TLR2-/-哮喘小鼠肺組織Hif-1陽性表達(dá)的細(xì)胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織；GRα陽

9、性表達(dá)細(xì)胞比率顯著低于正常組小鼠。
　　2.低氧時間依賴性下調(diào)GRα表達(dá)、激活MAPK信號通路，伴隨著Hif-1及TLR2表達(dá)上調(diào)。
　　低氧培養(yǎng)（氯化鈷1200umol/L）肺泡上皮A549細(xì)胞，培養(yǎng)不同時間，WesternBlot觀察不同時間點GRα和Hif-1蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)隨低氧作用時間延長， GRα表達(dá)逐漸下降，而Hif-1及TLR2表達(dá)顯著上升。低氧呈時間依賴性激活p38，JNK及ERK通路。
　　3.

10、靶向抑制p38信號通路可抵抗低氧導(dǎo)致的GRα下調(diào)。靶向干擾Hif-1可以抑制pJNK、pp38及TLR2活化，并且上調(diào)GRα表達(dá)。
　　分別預(yù)先加入SP600125，SB203580，U0126靶向抑制JNK，p38，ERK1/2信號蛋白，作用兩小時后更換培養(yǎng)基，加入 COCL2，作用12h，通過對蛋白的半定量分析，結(jié)果顯示抑制p38信號通路后，低氧所導(dǎo)致的GRα下調(diào)可以得到一定程度的修復(fù)。靶向干擾低氧環(huán)境下激活的Hif-1及TL

11、R2信號，Hif-1靶向干擾后， pERK活化未受到抑制，而活化的pp38及pJNK受到顯著抑制，且TLR2信號受到抑制。靶向干擾Hif-1可以上調(diào)低氧環(huán)境下受到抑制的GRα表達(dá)。TLR2靶向干擾后對GRα表達(dá)，Hif-1及MAPK信號家族的激活未有明顯影響。
　　4.低氧顯著抑制GRα核轉(zhuǎn)位。
　　常氧狀態(tài)下，細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10-5DXM后，活細(xì)胞動態(tài)顯示GRα迅速在10min內(nèi)全部轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，低氧培養(yǎng) A549細(xì)

12、胞，同樣加入10-5DXM入細(xì)胞培養(yǎng)基，顯示GRα入核的速度明顯減慢，并有一定比例的GRα不轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。
　　5.低氧抑制GRα與HSP的解離。
　　我們利用HSP和GRα可以相互結(jié)合的原理，用HSP90特異性吸附GRα，然后用Westernblot方法檢測GRα的表達(dá)量，實驗分為低氧和常氧組，低氧狀態(tài)下被HSP90吸附可以檢測的GRα量顯著高于常氧狀態(tài)下的GRα表達(dá)量。說明在低氧狀態(tài)下與HSP90結(jié)合的GRα多于低氧狀態(tài)

13、與HSP90的結(jié)合。
　　7. LTA刺激可以引起TLR2表達(dá)上升，GRα表達(dá)降低，Hif-1信號表達(dá)未見明顯變化。
　　將A549細(xì)胞給予LTA處理，WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)TLR2信號激活，但對Hif-1蛋白無明顯影響，GRα表達(dá)有一過性下降。
　　研究結(jié)論：
　　1.哮喘小鼠肺組織里的GRα表達(dá)顯著低于正常的小鼠肺組織；相反Hif-1表達(dá)在小鼠肺組織中明顯增高。
　　2．低氧通過激活MAPK信號