低氧調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體α表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）因其抗炎、抑制免疫、抗休克和抗毒等藥理作用，廣泛應(yīng)用于治療各種免疫炎癥性疾病，包括哮喘、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病。當(dāng)GC與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoids receptor，GR）結(jié)合后,其伴侶蛋白熱休克蛋白90（hot shock protein

2、90，HSP90）構(gòu)象發(fā)生改變, GRα-GC復(fù)合物與HSP90等配體成分分離，HSP90脫落，形成激素-受體復(fù)合物，GRα核易位進(jìn)入細(xì)胞核,在胞核內(nèi)與激素應(yīng)答基因啟動(dòng)區(qū)的激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response elements， GRES)結(jié)合,從而導(dǎo)致相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)并調(diào)控激素相關(guān)基因表達(dá)，產(chǎn)生生理及藥理作用。
　　糖皮質(zhì)激素的作用包括與受體結(jié)合及GC與GR結(jié)合之后引起的核轉(zhuǎn)位過(guò)程是極其復(fù)雜的，機(jī)體

3、的功能狀態(tài)及細(xì)胞所處的微環(huán)境均可影響其作用發(fā)揮。哮喘及慢性阻塞性肺病急性發(fā)作均存在不同程度的低氧血癥，前期研究顯示低氧時(shí)間依賴性抑制肺泡上皮A549細(xì)胞GRα的表達(dá)，但其信號(hào)通路及機(jī)制不明，且低氧是否會(huì)影響GRα核轉(zhuǎn)位尚不清楚。
　　研究目的：
　　本研究建立哮喘小鼠動(dòng)物模型，明確哮喘急性發(fā)作是否存在GRα的表達(dá)改變及低氧血癥。體外實(shí)驗(yàn)以人肺泡上皮A549細(xì)胞為模型，觀察低氧對(duì)GRα表達(dá)及MAPK信號(hào)通路的影響，靶向干預(yù)MA

4、PK信號(hào)通路，觀察GRα表達(dá)的變化，揭示低氧抑制GR表達(dá)的可能通路。觀察低氧對(duì)TLR2信號(hào)通路及Hif-1的影響，分別靶向干預(yù)TLR2信號(hào)通路及Hif-1，檢測(cè)TLR2信號(hào)蛋白、Hif-1及GR表達(dá)的變化，揭示低氧抑制GR表達(dá)的可能通路及TLR2與Hif的內(nèi)在關(guān)系。轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記的GRα質(zhì)粒入A549細(xì)胞，觀察低氧對(duì)GRα核轉(zhuǎn)位的影響。本研究旨在揭示低氧抑制GRα表達(dá)及核轉(zhuǎn)位的分子機(jī)制，為激素抵抗型哮喘的靶向干預(yù)提供理論依據(jù)和治療方向。

5、
　　研究方法：
　　1.建立OVA哮喘小鼠模型，實(shí)驗(yàn)分組包括正常對(duì)照組，哮喘組，TLR2-/-哮喘組，免疫組化方法及Western Blot檢測(cè)GRα及Hif-1蛋白表達(dá)的變化。
　　2.低氧培養(yǎng)A549細(xì)胞人肺泡上皮A549細(xì)胞放入普通培養(yǎng)箱（37℃，95％空氣，5%CO2），給予化學(xué)性低氧條件（COCL2，1200umol/L）培養(yǎng)0h，2h，4h，6h，8h，12h，24h。
　　3.Western Bl

6、ot法檢測(cè)低氧對(duì)各組細(xì)胞GRα、Hif-1、TLR2及MAPK信號(hào)家族包括磷酸化cJNK、ERK，p38表達(dá)的影響；靶向干預(yù)MAPK信號(hào)通路蛋白，觀察GRα表達(dá)的變化；轉(zhuǎn)染Hif-1及TLR2siRNA質(zhì)粒對(duì)之進(jìn)行特異性干擾，檢測(cè)MAPK信號(hào)通路蛋白及GRα的改變。
　　5.以脂磷壁酸激活TLR2通路蛋白，觀察TLR2信號(hào)通路激活狀態(tài)下GRα、Hif-1及TLR2表達(dá)的變化；
　　6.將A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶綠色熒光標(biāo)記的GFP

7、-GRα質(zhì)粒，運(yùn)用活細(xì)胞動(dòng)態(tài)工作站動(dòng)態(tài)觀察常氧及化學(xué)性低氧狀態(tài)下糖皮質(zhì)激素誘發(fā)GRα入核的時(shí)間及程度的變化。7.免疫共沉淀法檢測(cè)低氧對(duì)GR-HSP90二聚體解離的影響。
　　8.統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，每部分實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行3次完成。多組間差異采用one-way ANOVA方法分析，兩組之間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：

8、　　1.野生型哮喘小鼠肺組織中Hif-1表達(dá)顯著增強(qiáng)，GRα的表達(dá)下降，
　　免疫組化的結(jié)果顯示哮喘小鼠模型肺組織Hif-1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織細(xì)胞，IOD值高于正常對(duì)照組；GRα陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞比率顯著低于正常組小鼠，IOD值低于正常對(duì)照組，上述結(jié)果提示哮喘小鼠肺組織較之正常小鼠肺組織存在低氧狀態(tài)，并且GRα表達(dá)顯著下降。TLR2-/-哮喘小鼠肺組織Hif-1陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞比率顯著高于正常組小鼠肺組織；GRα陽(yáng)

9、性表達(dá)細(xì)胞比率顯著低于正常組小鼠。
　　2.低氧時(shí)間依賴性下調(diào)GRα表達(dá)、激活MAPK信號(hào)通路，伴隨著Hif-1及TLR2表達(dá)上調(diào)。
　　低氧培養(yǎng)（氯化鈷1200umol/L）肺泡上皮A549細(xì)胞，培養(yǎng)不同時(shí)間，WesternBlot觀察不同時(shí)間點(diǎn)GRα和Hif-1蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)隨低氧作用時(shí)間延長(zhǎng)， GRα表達(dá)逐漸下降，而Hif-1及TLR2表達(dá)顯著上升。低氧呈時(shí)間依賴性激活p38，JNK及ERK通路。
　　3.

10、靶向抑制p38信號(hào)通路可抵抗低氧導(dǎo)致的GRα下調(diào)。靶向干擾Hif-1可以抑制pJNK、pp38及TLR2活化，并且上調(diào)GRα表達(dá)。
　　分別預(yù)先加入SP600125，SB203580，U0126靶向抑制JNK，p38，ERK1/2信號(hào)蛋白，作用兩小時(shí)后更換培養(yǎng)基，加入 COCL2，作用12h，通過(guò)對(duì)蛋白的半定量分析，結(jié)果顯示抑制p38信號(hào)通路后，低氧所導(dǎo)致的GRα下調(diào)可以得到一定程度的修復(fù)。靶向干擾低氧環(huán)境下激活的Hif-1及TL

11、R2信號(hào)，Hif-1靶向干擾后， pERK活化未受到抑制，而活化的pp38及pJNK受到顯著抑制，且TLR2信號(hào)受到抑制。靶向干擾Hif-1可以上調(diào)低氧環(huán)境下受到抑制的GRα表達(dá)。TLR2靶向干擾后對(duì)GRα表達(dá)，Hif-1及MAPK信號(hào)家族的激活未有明顯影響。
　　4.低氧顯著抑制GRα核轉(zhuǎn)位。
　　常氧狀態(tài)下，細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10-5DXM后，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)顯示GRα迅速在10min內(nèi)全部轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，低氧培養(yǎng) A549細(xì)

12、胞，同樣加入10-5DXM入細(xì)胞培養(yǎng)基，顯示GRα入核的速度明顯減慢，并有一定比例的GRα不轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。
　　5.低氧抑制GRα與HSP的解離。
　　我們利用HSP和GRα可以相互結(jié)合的原理，用HSP90特異性吸附GRα，然后用Westernblot方法檢測(cè)GRα的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)分為低氧和常氧組，低氧狀態(tài)下被HSP90吸附可以檢測(cè)的GRα量顯著高于常氧狀態(tài)下的GRα表達(dá)量。說(shuō)明在低氧狀態(tài)下與HSP90結(jié)合的GRα多于低氧狀態(tài)

13、與HSP90的結(jié)合。
　　7. LTA刺激可以引起TLR2表達(dá)上升，GRα表達(dá)降低，Hif-1信號(hào)表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。
　　將A549細(xì)胞給予LTA處理，WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR2信號(hào)激活，但對(duì)Hif-1蛋白無(wú)明顯影響，GRα表達(dá)有一過(guò)性下降。
　　研究結(jié)論：
　　1.哮喘小鼠肺組織里的GRα表達(dá)顯著低于正常的小鼠肺組織；相反Hif-1表達(dá)在小鼠肺組織中明顯增高。
　　2．低氧通過(guò)激活MAPK信號(hào)