血清microRNA作為生物標(biāo)記物在結(jié)直腸腺癌早期診斷中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)直腸癌(colo rectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國，結(jié)直腸癌死亡率居惡性腫瘤第五位，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。結(jié)直腸癌大多經(jīng)歷了正常粘膜—腺瘤—腺癌的發(fā)展過程，即Nornal-Adenoma-Adenocarcinoma(N-A-AC)學(xué)說。腺癌是結(jié)直腸癌最主要的組織學(xué)類型，而腺瘤被公認(rèn)為結(jié)直腸腺癌最重要的癌前病變。結(jié)直腸腺癌早期不易發(fā)現(xiàn)，大多患者就診時已到中晚期，盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展，患者

2、術(shù)后5年生存率并無明顯改善，缺乏有效的診斷方法實現(xiàn)對結(jié)直腸腺癌及其癌前病變的早期診治是主要的原因之一，若能早期發(fā)現(xiàn)并切除結(jié)直腸腺癌及其腺瘤病變，將有助于降低其發(fā)病率及死亡率。目前，臨床上結(jié)直腸腺癌早期診斷主要依賴于腸鏡、影像學(xué)檢查和血清學(xué)標(biāo)志物癌胚抗原（Carcinoembryonicantigen，CEA）等，因具有侵入性或敏感性、特異性不足，而無法滿足臨床需求。尋找敏感性、特異性高的生物標(biāo)志物用于結(jié)直腸腺癌早期診斷仍是臨床亟待解決的

3、難題。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長度約19-24個核苷酸的非編碼小分子RNA，其異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，血液中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA，其表達譜具有明顯的組織特異性，在不同腫瘤中具有特異的表達譜，是具有潛在價值的腫瘤早期診斷生物標(biāo)志物。單一miRNA作為標(biāo)志物的敏感性和特異性仍難以滿足臨床需求，將差異miRNA組合建立腫瘤特異性表達譜將改進單一分子標(biāo)志物難以克服的低靈敏度、低特異性問題，

4、成為早期診斷的有效手段。若能獲得結(jié)直腸癌血清miRNA表達譜，可為其早期診斷提供一條新途徑。
　　在miRNA表達研究中，很多因素（如RNA的數(shù)量和濃度）可導(dǎo)致樣品測定結(jié)果出現(xiàn)偏差。目前，RT-qPCR是miRNA定量檢測最常用的方法，選用恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因是RT-qPCR定量檢測數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化最常用的方法，在miRNA研究中發(fā)揮重要作用。對于結(jié)直腸腺癌、腺瘤外周血miRNART-qPCR定量檢測，目前尚無適宜內(nèi)參基因篩選的相關(guān)研究報道。

5、
　　基于上述問題，本課題采用高通量Miseq測序技術(shù)，對結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對照組的血清miRNA進行了系統(tǒng)分析，確定標(biāo)準(zhǔn)篩選三組間無差異表達的miRNA和三組間漸進性升高或降低的差異表達miRNA，對上述無差異表達的miRNA進一步RT-qPCR驗證，并經(jīng)geNorm、Normfinder軟件評估，篩選用于結(jié)直腸腺癌血清miRNART-qPCR測定的最適合內(nèi)參，為下一步結(jié)直腸腺癌血清miRNA差異表達檢測及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化分析提供

6、了保障;以篩選出的內(nèi)參基因作為內(nèi)對照，將上述差異表達的miRNA進行逐個RT-qPCR驗證，篩選差異有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNA，運用ROC曲線評估各差異miRNA的診斷價值;采用多元logistic回歸分析方法將差異miRNA引入回歸方程，建立logit(P)判別公式，構(gòu)建miRNApanel;同時，對miRNApanel采用盲法分析，進行大樣本臨床驗證，評估其在結(jié)直腸腺癌診斷及鑒別診斷中的應(yīng)用價值。
　　第一部分：結(jié)直腸腺癌血清m

7、icroRNART-qPCR檢測最適內(nèi)參基因的選擇與驗證
　　研究目的：
　　實時熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前血清microRNA(miRNA)最常用的檢測方法，內(nèi)參基因的選擇對獲得可靠RT-qPCR分析數(shù)據(jù)至關(guān)重要。本研究旨在對結(jié)直腸腺癌患者血清miRNA定量PCR檢測中的內(nèi)參基因進行系統(tǒng)評估與驗證，篩選最適內(nèi)參基因。
　　方法：
　　收集30例結(jié)直腸腺癌、25例結(jié)直腸腺瘤和30例健康對照血清，采用高

8、通量Miseq測序技術(shù)對三組混合樣本進行測序，選擇在三組樣本中表達無差異的miRNA作為候選內(nèi)參基因;采用RT-qPCR技術(shù)在45例結(jié)直腸腺癌、40例結(jié)直腸腺瘤和40例健康對照血清中對篩選出的候選內(nèi)參基因和常用內(nèi)參基因U6snRNA進行驗證;利用geNorm和NormFinder兩種運算法則評估內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性，進一步選擇最適內(nèi)參基因;在60例結(jié)直腸腺癌、60例結(jié)直腸腺瘤和60例健康對照血清中對篩選出的最優(yōu)內(nèi)參基因進行驗證，并采用篩

9、選出的內(nèi)參基因評估m(xù)iR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌患者血清中的表達。
　　結(jié)果：
　　1.候選內(nèi)參基因的測序篩選:結(jié)直腸腺癌組與腺瘤組、結(jié)直腸腺癌組與健康對照組、腺瘤組與健康對照組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，拷貝數(shù)大于50且兩組間表達無差異的miRNA分別為17個、32個和25個。進一步分析，得到三組間表達均無差異的miRNA共13個，作為候選內(nèi)參基因。
　　2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗證:上述候選內(nèi)參基因中，有5個miRNA

10、(miR-151a-3p,miR-4446-3p,miR-221-3p,miR-93-5p和miR-3184-3p)在音分標(biāo)本中無法檢測到;miR-197-3p和miR-26a-5p的平均Cq值大于35;miR-103b,miR-484,miR-16-5p,miR-3615,miR-18a-3p,miR-191-5p和U6snRNA均可在所有標(biāo)本中檢測到且平均Cq值小于35。
　　3.所選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性評估:采用geNorm和

11、NormFinder兩個運算軟件評估上述7個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，GeNorm分析結(jié)果顯示miR-191-5p，miR-16-5p，U6snRNA和miR-18a-3p可作為內(nèi)參基因;geNorm和NormFinder均顯示miR-191-5p是表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，miR-191-5p和U6snRNA組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。
　　4.最適內(nèi)參基因的驗證:在另一獨立大樣本中進行驗證，結(jié)果顯示miR-191-5p，U6snRNA和m

12、iR-191-5p+U6snRNA組合在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對照組中表達均無統(tǒng)計學(xué)差異，在結(jié)直腸腺癌的不同分期患者中表達也無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5.MiR-92a-3p分子的表達:采用miR-191-5p+U6snRNA組合作為內(nèi)參，檢測血清miR-92a-3p分子在不同組的表達。結(jié)果顯示，miR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌患者中表達高于腺瘤和健康對照組(P＜0.001)，在腺瘤患者中的表達高于健康對照(P＜0.001)。MiR-9

13、2a-3p的表達隨結(jié)直腸癌患者TNM分期的進展而升高，血清miR-92a-3p表達在結(jié)直腸腺癌患者Ⅰ期與Ⅲ/Ⅳ期，Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期，Ⅲ期與Ⅳ期差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而在Ⅰ期與Ⅱ期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.66）。
　　結(jié)論：
　　MiR-191-5p和U6snRNA的組合可作為結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤和健康對照血清中miRNART-qPCR檢測的最適宜內(nèi)參基因。
　　第二部分：結(jié)直腸腺癌血清microRNApanel的建立及

14、臨床應(yīng)用
　　研究目的：
　　結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，目前用于其早期診斷的方法或具侵入性、或敏感性特異性不足尚無法滿足臨床需求。血清中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA，其作為標(biāo)志物為腫瘤早期診斷提供了一條新途徑。本研究旨在篩選結(jié)直腸腺癌差異表達miRNA，進而構(gòu)建miRNApanel用于結(jié)直腸腺癌的早期診斷。
　　方法：
　　收集30例結(jié)直腸腺癌、25例結(jié)直腸腺瘤和30例健康對照血清，采用高通量Miseq測

15、序技術(shù)對三組混合樣本進行測序，篩選結(jié)直腸腺癌差異表達miRNA，作為候選標(biāo)志物。采用RT-qPCR技術(shù)對上述差異miRNA驗證，進一步篩選差異有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNA，將差異miRNA引入多元logistic回歸分析，建立miRNApanel，采用ROC曲線評估該miRNApanel的診斷價值。
　　結(jié)果：
　　1.候選標(biāo)志物的篩選:測序結(jié)果顯示:結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對照組血清中拷貝數(shù)大于10的miRNA分別為348，30

16、3和283個。根據(jù)確定的篩選標(biāo)準(zhǔn)，miR-195-5p,miR-92a-3p,miR-1290,miR-582-5p,miR-223-3p,miR-136-5p,miR-3074-5p,miR-29a-3p,miR-221-3p,miR-148a-3p,miR-19a-3p和miR-17-3p在健康對照組、腺瘤和結(jié)直腸腺癌組呈漸進性高表達，而miR-422a，miR-1260a和miR-4502呈漸進性低表達。
　　2.差異miR

17、NA的RT-qPCR驗證:將上述15個差異表達miRNA在80個獨立樣本中進行RT-qPCR驗證，結(jié)果顯示miR-19a-3p，miR-223-3p和miR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌組表達高于腺瘤和對照，腺瘤組表達高于健康對照;miR-422a則呈漸進性低表達。進一步在240個樣本中檢測，ROC曲線評估m(xù)iR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a診斷結(jié)直腸腺癌的AUC分別為0.849，0.871，0

18、.890和0.843。
　　3.miRNAspanel的建立:將miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a引入多元logistic回歸分析，得到結(jié)直腸腺癌的判別公式為:logit(P)=0.3313-0.0081*miR-19a-3p-0.0257*miR-92a-3p-0.0406*miR-223-3p+0.1328*miR-422a，該4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌的AUC為0.

19、960。
　　4.miRNAspanel診斷價值驗證:進一步在獨立樣本中驗證發(fā)現(xiàn)，4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌的AUC為0.951(95％CI:0.907-0.978;敏感性和特異性分別為84.3％和91.6％)，高于傳統(tǒng)標(biāo)志物CEA(AUC:0.667，95％CI:0.593-0.735，P＜0.001);在CEA陽性組(＞5ng/mL)，其診斷AUC為0.918(95％CI:0.861-0.957;敏感性和特異性分別

20、為76.79％和85.56％);CEA陰性組（＜5ng/mL），其診斷AUC為0.810(95％CI:0.725-0.818;敏感性和特異性分別為57.14％和86.67％);該4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌TNMⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ患者的AUC分別為0.942，0.935，0.954和0.983;同時我們還分析了該4-miRNApanel對腺瘤的診斷和鑒別診斷價值，發(fā)現(xiàn)其鑒別診斷腺瘤和腺癌的AUC為0.886，區(qū)分腺瘤和健康對照的A