抗菌肽SMAP-29基因的設(shè)計(jì)、合成、表達(dá)純化及抗菌活性的檢測(cè).pdf

1、目的:
　　通過(guò)設(shè)計(jì)合成抗菌肽SMAP-29新基因,構(gòu)建其原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/SMAP-29,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化,得到大量具有抗菌活性的抗菌肽SMAP-29。
　　方法:
　　根據(jù)SMAP-29蛋白質(zhì)氨基酸序列,選用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子,同時(shí)兼顧了其 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能自行設(shè)計(jì)全新基因,基因采用 geneSOEing(gene splicing by overlap extension, geneSOE

2、ing)法合成,合成的基因克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中,通過(guò)酶切分析、PCR和測(cè)序鑒定篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)GST瓊脂糖FF層析柱純化,同時(shí)作凝血酶切割,再經(jīng) HPLC分離純化,獲得純度達(dá)95％的目的蛋白。檢測(cè)抗菌肽 SMAP-29的抗菌活性,采用微量肉湯稀釋法測(cè)定其對(duì)白色葡萄球菌(臨床株)、糞腸球菌耐藥株(耐氟喹諾酮類(lèi))、糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC29212)和大

3、腸桿菌(JM109)的MIC和MBC值。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)geneSOEing法合成的全新基因長(zhǎng)109bp(含限制性酶切位點(diǎn)),將其克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中,通過(guò)酶切分析、PCR和測(cè)序鑒定,其序列與所設(shè)計(jì)序列完全一致。SDS-PAGE電泳結(jié)果分析表明 pGEX-4T-1/SMAP-29可以在BL21中表達(dá)大小約29KD的GST-SMAP-29融合蛋白,經(jīng)凝血酶切割和分離純化后得到大小約3.2KDa的SMAP-