家蠶和果蠅的抗菌肽Cecropin B基因的表達(dá)及產(chǎn)物抑菌活性分析.pdf

1、抗菌肽Cecropin B是一種線性多肽，分子量約為4kD，在疏水環(huán)境中易形成兩親性(Amphipathic)α-螺旋，具有熱穩(wěn)定性，水溶性好。Cecropin B具有抗細(xì)菌、抗真菌等作用，近年來發(fā)現(xiàn)還有抗腫瘤及抗艾滋病病毒的活性，引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。從生物組織中分離獲得大量抗菌肽難度大，人工合成成本高，因此利用基因工程的方法表達(dá)抗菌肽成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。
　　 本研究構(gòu)建了原核和真核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)家

2、蠶（Bombyx mori）和果蠅（Drosophila melanogaster）抗菌肽Cecropin B2，并比較了兩種抗菌肽的活性。同時(shí)也在昆蟲桿狀病毒體系中表達(dá)了家蠶（Bombyx mori）抗菌肽Cecropin B2。獲得以下主要結(jié)果：
　　 1．根據(jù)大腸桿菌基因翻譯偏愛的密碼子，分別對其進(jìn)行優(yōu)化后，并用overlap extension PCR的方法擴(kuò)增獲得了家蠶和果蠅抗菌肽基因BmCecB2和DmCecB2，將

3、人工合成的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET32a重組，構(gòu)建了表達(dá)載體pET-32a-BmCecB和pET-32a-DmCec B，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blotting檢測，在預(yù)期的相應(yīng)位置出現(xiàn)了特異的蛋白條帶，表明Cecropin B基因在E.coli BL21(DE3)宿主菌中獲得成功表達(dá)。分離純化融合蛋白后，用腸激酶將N端的融合部分切除，得到完整抗菌肽，通

4、過沸水煮過后，抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)的Cecropin B蛋白具有抑菌活性。BmCecB2和DmCecB2表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性存在明顯差異：DmCecb2和BmCecb2表達(dá)產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其對大腸桿菌（E．Coli） DH5α的抑菌圈直徑分別為15和8mm左右，最小抑菌濃度分別為0.05、0.1mg/mL。結(jié)果說明DmCecb2的原核表達(dá)效率及表達(dá)產(chǎn)物的抑菌活性均明顯高于BmCecb2。
　　 2．采取Bac

5、-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)將抗菌肽Cecropin B基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，，該系統(tǒng)具有高效表達(dá)、無內(nèi)毒素污染、翻譯后修飾等優(yōu)勢。將家蠶抗菌肽Cecropin B基因及連接熒光標(biāo)記基因的Cecropin B分別克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacI，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBacI-BmcecB和pFastBacI-BmcecB-EGFP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，發(fā)生體內(nèi)重組，獲得桿粒Bacmid-BmcecB和Bacmi