利福平引起的肝內(nèi)膽汁淤積及其分子機理.pdf

1、利福平是臨床上廣泛使用的一線抗結(jié)核藥物，也是我國急性藥物性肝損傷的主要病因。本文首次系統(tǒng)觀察了體內(nèi)條件下利福平引起的肝內(nèi)膽汁淤積及其動態(tài)過程，并在成功建立利福平致小鼠肝內(nèi)膽汁淤積動物模型的基礎(chǔ)上，從肝細胞緊密連接蛋白基因表達和完整性改變、肝細胞膽汁酸合成與分解代謝以及膽汁酸的轉(zhuǎn)運過程等不同途徑，初步探討了利福平致肝內(nèi)膽汁淤積的部分分子機理。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴研究利福平致小鼠肝內(nèi)膽汁淤積的劑量-效應(yīng)關(guān)系，分別給予小鼠利福

2、平（100 mg/kg·d，150 mg/kg·d，200 mg/kg·d）灌胃，連續(xù)1周；為研究不同給藥時間對小鼠肝生化指標(biāo)的影響，分別給予小鼠利福平（200 mg/kg·d）灌胃，連續(xù)1周或兩周，末次給藥后6 h取材。血清生化檢測發(fā)現(xiàn)，利福平（200 mg/kg·d）1周所致的膽汁淤積性肝損傷最明顯。因此，本研究著重探討連續(xù)1周給予利福平（200 mg/kg·d）引起的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積及其分子機理。經(jīng)口給予利福平（200 mg/kg

3、·d）1周后，小鼠血清總膽紅素（TB）上升近70倍，結(jié)合膽紅素（DB）上升約82倍，堿性磷酸酶（ALP）上升約1.5倍，血清總膽汁酸（TBA）上升約8倍并伴有小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）輕度升高，這些結(jié)果與臨床膽汁淤積性肝損傷病人的肝生化指標(biāo)一致。此外，小鼠肝臟組織TBA上升約2.5倍，肝臟組織HE染色顯示肝細胞出現(xiàn)脂肪變性、輕度壞死和炎癥。為探討膽汁淤積發(fā)生與發(fā)展的時間過程，單次給予利福平（200

4、 mg/kg）后于不同時點（0.5h，2 h，6 h，12 h）取材，血清生化檢測發(fā)現(xiàn)，單次給予利福平0.5h后血清ALT、AST和ALP即開始輕度上升，2-6 h后達到高峰，12 h開始呈下降趨勢；而單次給予利福平后血清TB、DB和TBA的變化趨勢與血清ALT、AST和ALP一致，但是上升幅度更加明顯；單次給予利福平所有時點均未見小鼠肝臟組織病理學(xué)損害。這些研究結(jié)果提示，單次或連續(xù)1周給予利福平（200 mg/kg）均引起小鼠肝內(nèi)膽汁

5、淤積，并造成輕度的肝細胞損傷。
　　 ⑵探討肝細胞緊密連接蛋白相關(guān)基因表達的改變在利福平致小鼠肝內(nèi)膽汁淤積中的作用，采用RT-PCR技術(shù)檢測肝細胞緊密連接蛋白（ZO）-1、2、3，occludin和claudin-1 mRNA水平。結(jié)果顯示，盡管單次給予利福平（200 mg/kg）引起ZO-1和ZO-2 mRNA水平短暫下調(diào)，但連續(xù)給予利福平（200 mg/kg·d）1周對ZO-1、2、3，occludin和claudin-1

6、mRNA表達水平無明顯影響。探討肝細胞緊密連接完整性改變在利福平致肝內(nèi)膽汁淤積中的作用，采用免疫熒光技術(shù)檢測利福平對ZO-1和 occludin定位及完整性的影響。結(jié)果顯示，給予利福平（200 mg/kg·d）1周后，ZO-1和occludin蛋白條帶完整性受損，出現(xiàn)扭曲、斷裂和不完整的熒光條帶，胞漿內(nèi)ZO-1和occludin熒光強度明顯增強，提示ZO-1和occludin發(fā)生細胞內(nèi)陷；單次給予利福平（200 mg/kg）后0.5h，

7、ZO-1和occludin熒光條帶即出現(xiàn)變形、扭曲和不完整等改變，這些改變至少持續(xù)12 h。免疫熒光強度定量分析顯示，給予利福平（200 mg/kg·d）1周后，ZO-1熒光強度無明顯變化，而occludin熒光強度明顯下降；進一步觀察發(fā)現(xiàn)，單次給予利福平（200 mg/kg）后0.5h，ZO-1和occludin熒光強度即明顯下降，這種改變也至少持續(xù)12 h。這些研究結(jié)果提示，利福平通過改變肝細胞緊密連接完整性引起小鼠肝內(nèi)膽汁淤積，未

8、見利福平引起的肝內(nèi)膽汁淤積與肝細胞緊密連接蛋白基因表達有明顯的關(guān)聯(lián)。
　　 ⑶膽固醇7α羥化酶 （CYP7A1）是肝細胞膽汁酸合成關(guān)鍵酶，而細胞色素P450 3A (CYP3A) 是肝細胞膽汁酸分解關(guān)鍵酶。為探討膽汁酸合成和代謝過程在利福平致小鼠肝內(nèi)膽汁淤積中的作用，用RT-PCR技術(shù)檢測肝臟cyp7a1和cyp3a11 mRNA水平；用Western blotting技術(shù)檢測CYP7A1和CYP3A蛋白表達水平。結(jié)果顯示，給予

9、利福平（200 mg/kg·d）1周后，肝臟cyp7a1 mRNA水平和CYP7A1蛋白水平均明顯下降，而cyp3a11 mRNA和CYP3A蛋白水平顯著升高。進一步研究顯示，cyp7a1 mRNA和蛋白表達水平在給予單劑量利福平（200 mg/kg）后0.5h出現(xiàn)短暫升高但迅速下降；而cyp3a11 mRNA和CYP3A蛋白表達水平在給予單劑量利福平（200 mg/kg）后表現(xiàn)為迅速而持久的上升。這些研究結(jié)果提示，利福平引起的小鼠肝內(nèi)

10、膽汁淤積與膽汁酸合成及代謝無關(guān)。
　　 ⑷為探討膽汁酸轉(zhuǎn)運體在利福平致小鼠肝內(nèi)膽汁淤積中的作用，用RT-PCR技術(shù)檢測了小鼠肝細胞轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2、mrp3、ntcp、oatp1和oatp2的mRNA表達水平。初步研究結(jié)果顯示，給予利福平（200 mg/kg·d）1周后，肝細胞毛細膽管膜側(cè)的轉(zhuǎn)運體bsep、mrp2和mrp3 mRNA表達水平無明顯變化；肝細胞基底膜側(cè)轉(zhuǎn)運體ntcp mRNA表達水平輕度下調(diào)，而oatp1

11、和oatp2 mRNA表達水平無明顯變化。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，給予單劑量利福平（200 mg/kg）后，ntcp mRNA表達水平表現(xiàn)為快速而持久的下降；而bsep、mrp2、mrp3、oatp1和oatp2 mRNA水平均無明顯變化。
　　 ⑸根據(jù)以上研究結(jié)果，本文得出以下結(jié)論：①連續(xù)多次及單次給予利福平均引起小鼠肝內(nèi)膽汁淤積；②利福平所致的小鼠肝內(nèi)膽汁淤積與肝細胞緊密連接蛋白ZO-1和occludin的完整性破壞有關(guān)；③利福平引