冬凌草甲素抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，它的惡性程度高、預(yù)后不佳，因此嚴(yán)重威脅著人類的健康。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療包括:手術(shù)切除腫瘤、放射治療和化學(xué)治療，然而歷經(jīng)了一個(gè)多世紀(jì)的治療進(jìn)程后，至今仍沒有突破性的進(jìn)展。近年來新發(fā)展的免疫治療、基因治療等生物治療技術(shù)，主要作用于于腫瘤發(fā)生的信號通路，然而這些新技術(shù)在臨床或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并沒有明顯改善生存率。冬凌草甲素(Oridonin)是由中草藥冬凌草中提純的一種化學(xué)物質(zhì)，它被認(rèn)為在人類腫

2、瘤的發(fā)生中能夠發(fā)揮廣泛的抗腫瘤效應(yīng)。目前關(guān)于Oridonin對于肺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等方面均已進(jìn)行了系列研究，而Oridonin對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用尚未有深入研究。
　　目的:1、通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞增殖能力檢測，評價(jià)Oridonin對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響;2通過流式細(xì)胞周期檢測，明確Oridonin對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖周期的影響;3、通過檢測細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探索Oridonin通過誘

3、導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長的機(jī)制;4、通過荷瘤小鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，闡明Oridonin在體內(nèi)對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的影響以及組織內(nèi)細(xì)胞凋亡和增殖的影響。
　　方法:采用體外培養(yǎng)U87、U251細(xì)胞，分為對照組和不同濃度Oridonin處理組，并給予相應(yīng)處理。通過MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的增值能力和細(xì)胞克隆形成數(shù)量;通過AnnexinⅤ-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測U87和U251細(xì)胞存活、早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞

4、比例;通過Hoechst33342染色檢測U87和U251細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變;通過PI染色和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測U87和U251細(xì)胞的細(xì)胞周期改變;通過提取細(xì)胞總蛋白和線粒體、胞質(zhì)內(nèi)蛋白，BCA蛋白定量后利用Western Blot分析檢測U87和U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況;過腹膜內(nèi)注射U87細(xì)胞建立裸鼠荷瘤模型，Oridonin飼養(yǎng)第28天后處死小鼠取出腫瘤組織，檢測小鼠體內(nèi)腫瘤重量和體積的變化;通過對分離出腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化

5、學(xué)染色，檢測體內(nèi)腫瘤組織內(nèi)caspase-3和PCNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)U87和U251細(xì)胞系都表現(xiàn)出對Oridonin的敏感性，隨著Oridonin用量的增加和藥物培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞的存活率也逐步受到抑制。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):Oridonin處理組相對于對照組U87、U251細(xì)胞克隆均明顯受到抑制。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，經(jīng)過Oridonin處理后U87、U251細(xì)胞分裂處于S期的

6、細(xì)胞比例明顯增加，相應(yīng)的處于G2/M期的細(xì)胞比例下降;處于G1期的細(xì)胞比例明顯下降。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，經(jīng)過各組濃度Oridonin處理的U87和U251細(xì)胞細(xì)胞中的CyclinA的表達(dá)量明顯下降;CyclinD1和Cyclin B1的表達(dá)量均有明顯下降。Hoechst33342染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Oridomin處理24h后，U87和U251細(xì)胞均可見核溶解后出現(xiàn)的碎裂核及濃縮核，并且隨著Orido

7、nin濃度的增加，相對于對照組碎裂核及濃縮核逐漸數(shù)量明顯增加。流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Oridomin處理48h后U87和U251細(xì)胞的存活率均隨著Oridonin用量的增加而顯著降低，同時(shí)凋亡細(xì)胞的比例顯著增加。在U87細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，隨著Oridonin量的增加，處于早期凋亡和晚期凋亡階段細(xì)胞的比例顯著增加。在U251細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，10μM/L Oridonin組早期凋亡比例顯著高于對照組，2.5μmol/L和5μmol/L Ori

8、donin組與對照組比較，早期凋亡細(xì)胞比例無明顯差異;5μmol/L和10μmol/L Oridonin組細(xì)胞的晚期凋亡比例顯著高于對照組，2.5μmol/L Oridonin組與對照組比較，晚期凋亡細(xì)胞比例無明顯差異。Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Oridomin處理后U87和U251細(xì)胞的抗凋亡因子Bcl-2、促存活因子NF-κB的表達(dá)均明顯降低;反之，促凋亡因子cleaved-caspase-3、cleaved

9、-caspase-9和PARP-1的表達(dá)量明顯升高。經(jīng)過Oridonin處理后的U87、U251細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Bax表達(dá)水平降低，線粒體內(nèi)的Bax表達(dá)量升高，胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞色素C的表達(dá)量升高。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Oridonin腹腔注射處理組的腫瘤組織重量明顯小于對照組;Oridonin處理第13天出現(xiàn)腫瘤體積明顯減小，飼養(yǎng)第27天，Oridonin處理組的腫瘤組織平均體積為明顯小于對照組。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Oridonin處理組的cleabed