白藜蘆醇抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及裸鼠移植瘤血管形成實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從多種葡萄屬植物、花生、紅葡萄酒和各種食品原料中提取出的多酚類化合物。Res的研究已有30多年的歷史，早期主要集中于它在抗菌、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗自由基等方面的作用。近年來，實(shí)驗(yàn)證明其作為抗癌劑及腫瘤化學(xué)預(yù)防劑，在腫瘤啟動、促進(jìn)及發(fā)展3個(gè)階段都顯示抗腫瘤功效，并且對白血病、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞均有顯著抑制作用。 對于被確診為惡性膠質(zhì)瘤的患者來說是很不幸的，即使采取

2、包括手術(shù)、放療和化療等多學(xué)科的治療手段，該類患者的存活時(shí)間從確診之日起一般超不過1年，其5年存活率＜5.5％。雖然治療藥物有很多，但是大多數(shù)的副作用較強(qiáng)，研究出一種更好的治療惡性膠質(zhì)瘤的藥物非常必要。Res作為一種天然來源的多酚類化合物很有可能成為治療膠質(zhì)瘤的有效藥物。 雖然Res可以抑制多種癌細(xì)胞的生長，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞抗腫瘤作用的報(bào)道還很少。Res的抗腫瘤機(jī)制也很多，減少腫瘤血管形成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋

3、亡可能是兩種比較重要的機(jī)制。而且Res導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制也不清楚。不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對Res的敏感性也是不同的。深入研究Res抑制不同人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用效能，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的信號激活途徑以及對裸鼠移植瘤血管形成的影響，不僅可以為臨床腫瘤治療設(shè)計(jì)更好的用藥策略提供理論依據(jù)，而且也可以為針對不同抗腫瘤途徑的聯(lián)合用藥，提高藥物抗腫瘤的效率，降低細(xì)胞的毒性反應(yīng)提供有價(jià)值的線索。本課題對以上方面進(jìn)行了初步研究。 第一部分R

4、es抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)凋亡的體外實(shí)驗(yàn)1、Res誘導(dǎo)SHG-44、U87、U251細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期改變我們用HE染色、Hoechst33342熒光染色和透射電鏡觀察3種細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變，DNAladder實(shí)驗(yàn)檢測SHG-44凋亡細(xì)胞的DNA裂解情況，流式細(xì)胞儀測定3種細(xì)胞周期的改變。通過觀察凋亡的細(xì)胞形態(tài)可見，細(xì)胞變圓，細(xì)胞核固縮、深染，核染色質(zhì)致密、形狀不一，大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜。熒光染色觀察可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮

5、、熒光信號強(qiáng)。透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞表面絨毛消失、表面光滑，細(xì)胞膜表面有出泡現(xiàn)象，線粒體崩解，染色質(zhì)晚期碎裂、邊集。SHG-44凋亡細(xì)胞形成了DNA梯度，且隨著Res作用濃度的增高，梯度越明顯。流式細(xì)胞儀測定SHG-44、U87、U251細(xì)胞周期均發(fā)生G1期比例升高，S、G2期比例降低。說明Res確實(shí)可導(dǎo)致人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及細(xì)胞周期改變。 2、Res抑制SHG-44、U87、U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)凋亡比較常規(guī)復(fù)蘇人

6、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG-44、U87、U251進(jìn)行培養(yǎng)，四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測量不同劑量的Res作用3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞24h后對增殖的影響及不同劑量的Res作用6h、24h和48h后對3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀用AnnexinV-FITC和PI雙染法檢測3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率。Res明顯抑制U251、U87和SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和增殖，呈濃度及時(shí)間依賴性反應(yīng)，且對U87細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，U251和SHG-44細(xì)胞次之；Res所

7、致的3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡為濃度依賴關(guān)系，且對U87細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于U251和SHG-44細(xì)胞。說明Res對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，且篩選出了受抑制及凋亡最強(qiáng)的U87細(xì)胞進(jìn)行下一步機(jī)理及動物實(shí)驗(yàn)研究。 第二部分Res誘導(dǎo)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理及動物實(shí)驗(yàn)1、Res誘導(dǎo)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡過程中Caspase-3的激活我們選用對Res更為敏感的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡機(jī)理研究，采用Western-blot法分析Caspase-

8、3酶原的變化，半定量RT-PCR檢測Caspase-3mRNA水平的改變。比色法測定Caspase-3的相對活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨用藥濃度增加，Caspase-3酶原的蛋白水平減少，Caspase-3的mRNA水平增加(P＜0.01)。用200μmol/LRes分別處理U87細(xì)胞后,Caspase-3活性于2h開始升高，12h達(dá)高峰(P＜0.01)；用不同濃度的Res處理細(xì)胞12h，Caspase-3活性呈濃度依賴性的升高(P＜0.01

9、)。說明Res誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡過程中有Caspase-3的激活。 2、Res對U87裸鼠移植瘤生長及血管形成的影響建立人腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠皮下移植瘤模型。采用腹腔注射的方法，用不同劑量的Res進(jìn)行治療并設(shè)對照。取裸鼠移植瘤制作切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中微血管密度(MVD)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的蛋白表達(dá)，采用原位末端標(biāo)記法檢測腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞。結(jié)果表明Res顯著抑制U87裸鼠移植瘤的生長(P＜0.01)

10、，抑制率達(dá)50.3％；100mg/(kg·d)Res處理組腫瘤組織中MVD及VEGF的表達(dá)明顯低于對照組；100mg/(kg·d)Res處理組腫瘤內(nèi)大量細(xì)胞發(fā)生凋亡，與空白對照組及溶劑對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說明Res對U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長具有明顯抑制作用，這種作用與Res導(dǎo)致U87移植瘤細(xì)胞凋亡及血管形成減少有關(guān)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對Res抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)凋亡及減少U87裸鼠移植瘤血