牛源A型多殺性巴氏桿菌三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能研究.pdf

1、其中TAAs的Ylhead頭部基序主要位于N端211-284aa處，莖部主要位于295-341aa，C端錨定部基序主要位于323-411aa處，說(shuō)明該蛋白含有三聚體典型的頭-莖-錨結(jié)構(gòu)，從理論上證明該假定蛋白是三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。利用Bcepred Server在線軟件對(duì)蛋白Pm1g0001的B抗原表位進(jìn)行線性化的預(yù)測(cè)；利用BepiPred1.0 Server在線軟件和DNAstar軟件包分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原指數(shù)、親水性、可

2、極性等，預(yù)測(cè)蛋白Pm1g0001的B抗原表位，綜合分析表明，Pm1g0001的抗原表位主要位于21-315 aa。
　　2、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的分段表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析
　　生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三聚體部分主要位于Pm1g0001基因編碼蛋白的211-411aa。根據(jù)分析結(jié)果，將Pm1g0001分為整個(gè)Pm1g0001基因（Pm1g0001）、整個(gè)功能區(qū)（頭部和頸部：Pm1g0001-1）、錨

3、定部（Pm1g0001-2）、整個(gè)三聚體部分（Pm1g0001-3）、非三聚體部分（Pm1g0001-4）、頭部（Pm1g0001-5）和莖部（Pm1g0001-6）7段，分別設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，以pET-30a（+）或pET-32a（+）為載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到重組蛋白。利用His親和層析柱將7個(gè)重組蛋白進(jìn)行大量純化，并將產(chǎn)物

4、進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個(gè)重組蛋白都具有良好的反應(yīng)原性；此外，重組蛋白rPm1g0001-2在78KDa處有條帶，是單體重組蛋白（26KDa）的3倍，說(shuō)明該蛋白錨定部具有三聚化的作用，由此證明蛋白Pm1g0001是三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員。
　　3、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pm1g0001的功能研究
　　將純化后的重組蛋白rPm1g0001、rPm1g0001-1~rPm1g0001-6分別與佐劑混合后免疫小鼠

5、，三免后，采集小鼠血液分離血清，采用ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)；同時(shí)用6.8×105CFU的PmCQ2肌肉注射攻毒小鼠，研究目的蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，免疫組抗體效價(jià)范圍在1:51200~1:102400，說(shuō)明重組蛋白可以刺激小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答反應(yīng)；其中重組蛋白rPm1g0001-3的抗體效價(jià)明顯高于其余6組，說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體。攻毒保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組蛋白rPm1g0001-3的保

6、護(hù)效果最好，保護(hù)率達(dá)到70％，說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)粘附素對(duì)巴氏桿菌的感染具有很好的保護(hù)作用；重組蛋白rPm1g0001-5和rPm1g0001的保護(hù)率達(dá)到60%，rPm1g0001-1和rPm1g0001-6的保護(hù)率是40%，rPm1g0001-2保護(hù)率僅為10%，說(shuō)明在整個(gè)rPm1g0001中起主要作用的是三聚體部分，而在三聚體中起主要作用的是功能區(qū)，其中功能區(qū)頭部作用效果好于莖部。
　　將純化后的重組蛋白rPm1g0001-1、r

7、Pm1g0001-3、rPm1g0001-5、rPm1g0001-6免疫小鼠，制備多克隆抗體。用制備好的抗體和陰性血清對(duì) C57BL/6小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，加入PmCQ2感染4h，洗去未粘附的細(xì)菌，經(jīng)洗脫后進(jìn)行粘附計(jì)數(shù)，以研究重組蛋白抗體對(duì)巴氏桿菌粘附小鼠巨噬細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，四種多克隆抗體都對(duì)PmCQ2粘附巨噬細(xì)胞有一定的抑制作用，且差異顯著；其中抗-Pm1g0001-3對(duì)細(xì)菌粘附的抑制效果明顯好于其余三組，說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)

8、蛋白抗體對(duì)巴氏桿菌粘附宿主細(xì)胞具有一定的抑制作用，其中起主要作用的是功能區(qū)。
　　將PmCQ2（1×108 CFU）加入細(xì)胞培養(yǎng)板中分別培養(yǎng)24h、48h、72h，檢測(cè)生物膜形成情況，在此基礎(chǔ)上，將制備的多克隆抗體抗-Pm1g0001-1、抗-Pm1g0001-3、抗-Pm1g0001-5、抗-Pm1g0001-6與陰性血清分別對(duì)含細(xì)菌的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行預(yù)處理，并測(cè)定各組的吸光值 A630，以研究重組蛋白抗體對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響。

9、結(jié)果表明，多殺性巴氏桿菌PmCQ2可以形成細(xì)菌生物膜，48h時(shí)形成生物膜現(xiàn)象最明顯；經(jīng)抗體預(yù)處理的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組A630極顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明4種抗體都能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成，且在48h時(shí)抑制效果最好；48h時(shí)，抗-Pm1g0001-1的抑制效果最佳，抗-Pm1g0001-3的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5和抗-Pm1g0001-6，抗-Pm1g0001-6的抑制效果好于抗-Pm1g0001-5，說(shuō)明三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體可以抑制細(xì)菌