ErbB2入核機(jī)制研究初探.pdf

1、ErbB2作為細(xì)胞表面膜受體與其它EGFR家族成員形成異源二聚體而發(fā)揮作用．最近的研究報(bào)道ErbB2可定位于細(xì)胞核，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于ErbB2分子能否入核一直存有爭議。 本研究第一部分將全長ErbB2融合于GFP N端，發(fā)現(xiàn)全長ErbB2在過表達(dá)的情況下不入核。病毒蛋白PF-8的NLS亦不能有效驅(qū)動(dòng)ErbB2全長分子的核轉(zhuǎn)位，表明ErbB2分子的固有特性使其更傾向定位于胞膜。對(duì)ErbB2的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)

2、，ErbB2 ICD N端含有一個(gè)假定的NLS。通過構(gòu)建不同形式的ErbB2突變體，采用間接免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡術(shù)觀察到，ErbB2 ICD具有顯著的入核傾向，去除此NLS雖然不能完全阻斷ErbB2 ICD的核定位，但對(duì)其入核可產(chǎn)生較明顯的干擾作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2 ICD分子內(nèi)蘊(yùn)藏決定其細(xì)胞內(nèi)定位的重要信息，在不同種屬EGFR家族成員中897位精氨酸具有高度的保守性，含有<,896>RRR<,898>三聯(lián)精氨酸的序列(

3、殘基721-970)與ErbB2胞質(zhì)內(nèi)定位相關(guān)。 雖然ErbB2的核定位已在腫瘤組織中被檢測到，但在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，ErbB2入核一直未被廣泛認(rèn)同。腫瘤微環(huán)境對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有至關(guān)重要的意義，特別是間質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的交互作用直接影響腫瘤細(xì)胞的黏附、移動(dòng)、增殖、分化和侵襲。本研究第二部分模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，將乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞與纖維肉瘤細(xì)胞系HT1080共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)能促進(jìn)HT1080細(xì)胞中MMP

4、-2和MMP-9表達(dá)乃至激活，而SKBR3細(xì)胞與HT1080細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)均不能產(chǎn)生激活形式的MMP-2和MMP-9。同時(shí)，共培養(yǎng)可導(dǎo)致SKBR3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的顯著變化，細(xì)胞由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，胞體增大，胞質(zhì)伸出多個(gè)突起，呈現(xiàn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的形態(tài)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)，提示腫瘤間質(zhì)細(xì)胞對(duì)于腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的惡性演進(jìn)具有至關(guān)重要作用。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及用HT1080細(xì)胞培養(yǎng)上清處理SKBR3細(xì)胞可導(dǎo)致SKBR3細(xì)胞表達(dá)的ErbB2 ECD波

5、有效切割，且隨處理時(shí)間的延長裂解效應(yīng)更加顯著，提示間質(zhì)細(xì)胞及其分泌的蛋白水解酶與乳腺癌細(xì)胞釋放ErbB2 ECD密切相關(guān)。這種酶解作用可被EDTA有效地抑制，佐證了ErbB2 ECD的切割可能與MMP-2和MMP-9的活化有關(guān)。進(jìn)一步模擬腫瘤組織內(nèi)部因腫瘤細(xì)胞快速增殖而造成的缺氧環(huán)境，將SKBR3細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)12 h，觀察到大量ErbB2蛋白聚集于SKBR3細(xì)胞核一側(cè)，并清楚地觀察到ErbB2分子沿核的一側(cè)已“滲透”進(jìn)入胞核內(nèi)。而單

6、純?nèi)毖趸騿为?dú)HT1080細(xì)胞培養(yǎng)上清處理，均未能觀察到ErbB2的核轉(zhuǎn)位，提示間質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用及腫瘤組織的缺氧微環(huán)境是誘導(dǎo)ErbB2核定位的先決條件。 總之，本研究通過構(gòu)建不同ErbB2突變體表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，理論上證實(shí)ErbB2有入核潛能，進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及缺氧條件下成功誘導(dǎo)了ErbB2的核轉(zhuǎn)位。但是，目前我們尚不能確定發(fā)生核定位的ErbB2分子為何種形式。與HT1080細(xì)胞共培養(yǎng)或用HT1080細(xì)