Spt4-Spt5結合DNA以及抗體E9結合ErbB2的結構生物學研究.pdf

1、基因表達是一個復雜并且受到多重調控的精細過程，包括了轉錄、翻譯和翻譯后修飾三個過程，并受到多種蛋白質復合物的調控。基因表達的第一步是轉錄，由RNA聚合酶催化，將遺傳信息從DNA傳遞到RNA。調節(jié)基因轉錄的蛋白質被稱作轉錄因子，轉錄因子在原核、古核、真核三界中的保守程度并不高，但唯一例外的是Spt5/NusG家族。Spt5（原核中被稱作NusG）是唯一在三界中都存在的轉錄因子。在古核和真核生物中，Spt5可以和Spt4形成穩(wěn)定的異二聚體發(fā)

2、揮功能;但在原核生物中并不存在Spt4的同源蛋白，因而NusG獨自發(fā)揮功能。前人的工作已經證明，Spt4∶Spt5復合物與RNA聚合酶直接相互作用，并結合在RNA聚合酶clamp結構域的coiled-coil模體上。Spt4∶Spt5所處的這一位置位于DNA出口處，在這里，完成了轉錄的DNA重新形成雙螺旋結構，并通過DNA出口排出。
　　在本次工作中，我們通過核磁共振化學位移擾動和熒光偏振實驗首次證實了Spt4∶Spt5結合DNA

3、的能力;并通過解析和分析MjSpt4∶Spt5的晶體結構，猜測了一個位于Spt4∶Spt5上可能的DNA結合區(qū)域;并從兩套衍射數據解析的模型中捕捉到了Spt4∶Spt5兩種不同的構象，進而分析了兩種構象對Spt4∶Spt5結合DNA能力的影響;通過結合定點突變和熒光偏振實驗，我們最終構建了一個Spt4∶Spt5結合DNA的模型，進而構建了一個包含了RNA聚合酶、Spt4∶Spt5復合物和DNA三個元素的RNA聚合酶DNA出口模型，并通過

4、生化實驗和計算機模擬驗證了此模型的正確性。
　　ErbB2隸屬于酪氨酸蛋白激酶家族中的表皮生長因子受體亞家族，這類跨膜蛋白通過胞外結構域的二聚化激活其胞內區(qū)的酪氨酸激酶活性，進而互相催化對方的胞內結構域C末端尾巴并進一步激活下游信號通路。ErbB2負責調控包括細胞復制和凋亡的多條重要信號通路，其活性異常會導致乳腺癌等近十種癌癥，并有著更高轉移性。因而，近年來ErbB2成為了抗腫瘤治療的重要靶標分子。
　　中國科學技術大學的細

5、胞與分子免疫學實驗室近年來一直致力于抗ErbB2抗體的研發(fā)，并開發(fā)了一株具有抗腫瘤活性的人鼠嵌合抗體chA21。近期，該實驗室完成了對chA21的人源化，并通過親和力成熟技術制備了具有高親和力的人源化抗ErbB2抗體E9。我們與細胞與分子免疫學實驗室合作，通過X射線衍射方法解析了E9 scFv片段與ErbB2完整胞外結構域的晶體結構，確認了E9在ErbB2上的結合位置;并發(fā)現在抗原—抗體結合界面上，原先chA21所結合的抗原表面三條lo