不同發(fā)育時期小鼠睪丸引帶ERα、ERβ、GPER表達的研究.pdf

1、目的:
　　睪丸引帶是影響睪丸下降的重要因素。在不同發(fā)育時期,睪丸引帶變化不同,包括生長、增大、退化、收縮等,這些變化與胚胎期睪丸的發(fā)育和下降密切相關(guān)。睪丸的發(fā)育和下降不全影響睪丸的功能,并進而直接影響雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育。近年來研究表明,外源性雌激素可引起雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常增加。在有關(guān)的機理方面,已有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的雌激素受體(ERα和ERβ)可以不同程度地表達于睪丸引帶組織,此外,也發(fā)現(xiàn)新型雌激素受體--G蛋白偶聯(lián)的雌激素膜受體

2、(GPER/GPR30)也表達于睪丸、膀胱、輸精管等男性泌尿生殖器官。提示雌激素有可能通過多種受體途徑影響男性泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育。雌激素(包括外源性雌激素)與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常的相關(guān)關(guān)系及機理目前備受關(guān)注,其中,外源性雌激素對睪丸引帶的影響還很少研究。本實驗通過免疫組織化學,免疫電鏡,western blot等多種方法對不同發(fā)育時期小鼠睪丸引帶中的上述三種雌激素受體進行了定性、定位和定量的研究。以期了解三種雌激素受體在睪丸引帶中的表達

3、,為后續(xù)研究雌激素通過睪丸引帶途徑影響小鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的機理奠定基礎。
　　材料和方法:
　　昆明小鼠90只,按雌雄比例2:1合籠交配,以出現(xiàn)陰道栓作為受孕標志,發(fā)現(xiàn)陰栓當天定為妊娠0天,記為GD0(gestation day,GD),胎鼠組分別于GD17、GD19時取材。孕雌鼠待其自然分娩,以幼鼠出生當天記為生后0天,計為PD0(postnatal day,PD)。分別于PD0、PD3、PD7、PD14、PD21時取材。<

4、br>　　分析不同發(fā)育時期(胎齡17天、19天,生后0天、3天、7天、14天、21天)小鼠睪丸引帶中雌激素受體(ERα、ERβ、GPER)的表達情況:
　　1.取上述不同發(fā)育時期的小鼠睪丸引帶,利用免疫組織化學檢測睪丸引帶上三種雌激素受體的表達情況。
　　2.取3天小鼠睪丸引帶,利用免疫電鏡技術(shù)對三種雌激素受體進行定位,了解其表達情況。
　　3.取上述不同發(fā)育時期的小鼠睪丸引帶,利用蛋白質(zhì)印跡方法了解三種雌激素受體的表

5、達情況(定量)。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組織化學觀察:各個時間點的小鼠睪丸引帶上ERα、ERβ及GPER陽性細胞均呈棕黃色或棕褐色,主要表達在睪丸引帶內(nèi)層疏松的間葉組織區(qū)內(nèi),外周較致密的細胞區(qū)內(nèi)弱表達或不表達。
　　2.免疫組織化學染色:隨著小鼠天齡的增加,可見各組ERα及GPER的陽性染色細胞均為生后3天小鼠睪丸引帶最高,但GPER的陽性染色細胞較ERα明顯弱且少;ERβ陽性染色細胞為生后0天最高。統(tǒng)計學分析結(jié)果:

6、①ERα表達分析:生后0天、3天兩兩相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05),余各發(fā)育階段組兩兩相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②ERβ表達分析:孕17天與孕19天兩兩相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),及生后0天與各組兩兩相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05),余各發(fā)育階段之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。③GPER表達分析:孕17天、孕19天、生后7天、生后14天、生后21天與各組之間相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);生后0天、3天兩兩相比無統(tǒng)

7、計學意義(P>0.05)。
　　3.免疫電鏡觀察:①ERα:細胞核可見散在的膠體金顆粒標記。②ERβ:細胞核和細胞質(zhì)可見少量膠體金顆粒標記。③GPER:細胞質(zhì)內(nèi)偶見個別膠體金顆粒標記。
　　4.Western blot檢測:隨著小鼠天齡的增加,均檢測到ERα、ERβ及GPER的表達,各組目的蛋白表達均不一致。經(jīng)統(tǒng)計學分析:①ERα的表達量:胎齡時期(孕17天、孕19天)兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05);生后0天、生后

8、3天兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05);其余各組之間相互比較差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。②ERβ的表達量:孕19天、生后0天、生后3天兩兩比較差異存在統(tǒng)計學意義(p<0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。③GPER的表達量:孕17天、孕19天與生后各組之間比較均有差異(p<0.05);生后3天與各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05);生后7天、14天、21天與生后各組(生后3天、7天、14天、21天

9、)比較差異均有統(tǒng)計意義(p<0.05),其余各組之間無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.正常小鼠睪丸引帶組織中,各個發(fā)育階段均有ERα、ERβ及GPER表達,但表達的位置及含量均不一致。
　　2.正常小鼠睪丸引帶組織中,ERα、ERβ及GPER主要存在于睪丸引帶內(nèi)層疏松間葉組織區(qū),外周致密區(qū)表達弱或不表達。
　　3.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的ERα主要表達于細胞核中,睪丸下降第一階段

10、較第二階段前表達逐漸增加,第二階段后表達逐漸減弱。
　　4.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的ERβ表達于細胞核和細胞質(zhì)中,在睪丸下降的第一階段其表達逐漸增加,第二階段也有表達但無差異性(其蛋白定量研究尚需進一步確定)。
　　5.隨著小鼠天齡的增加,小鼠睪丸引帶組織中的GPER主要表達于細胞膜及細胞質(zhì)。睪丸下降第一階段表達量逐漸增加,第二階段逐漸減弱。
　　綜上,本實驗研究提示不同發(fā)育時期的小鼠睪丸引帶組織均有E