小鼠睪丸引帶細胞培養(yǎng)及已烯雌酚對培養(yǎng)睪丸引帶細胞的影響.pdf

1、目的:
　　許多研究表明,人類精子數(shù)和精液量在明顯下降,男性生殖系統(tǒng)分化和發(fā)育異常則明顯增加,同時環(huán)境雌激素(EEs)對男性生殖系統(tǒng)的影響也日益明顯,且大多數(shù)與睪丸發(fā)育、下降不全相關(guān),而睪丸引帶與睪丸發(fā)育、下降關(guān)系密切。目前這方面還有許多問題尚未研究清楚,特別的是在EEs的作用機理方面。本實驗通過建立小鼠睪丸引帶細胞培養(yǎng)方案,利用經(jīng)典的EEs己烯雌酚(DES)直接作用于培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞,觀察細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,并研究DES對

2、培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞增殖和收縮活性等的影響。以探討外源性雌激素(EEs)影響睪丸下降的可能機理。
　　材料和方法:
　　小鼠睪丸引帶細胞原代培養(yǎng)
　　脫頸椎處死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪開下腹部,再次辨認(rèn)雌雄,在3倍手術(shù)放大鏡下于膀胱兩側(cè)游離出完整睪丸、附睪及睪丸引帶,置于PBS中剔除出大部分睪丸引帶組織。將引帶組織放入含Ⅰ型膠原酶(1mg/ml)的DMEM培養(yǎng)液中,37℃持續(xù)震蕩消化1小時后,加入3-4倍含無雌

3、激素血清的培養(yǎng)液終止消化作用,靜置后取上清液用25μm孔徑過濾器過濾,1000r/min離心濾液5min,棄上清。細胞沉淀加入含無雌激素胎牛血清(10％v/v)DMEM培養(yǎng)基,吹打成單個細胞懸液,接種于25cm培養(yǎng)瓶中,置于5% CO2、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)不同的培養(yǎng)情況將帖壁的睪丸引帶細胞分別傳代接種到6孔板和96孔板中。臺盼藍染色計數(shù)法確定細胞存活率。
　　DES對小鼠睪丸引帶細胞的影響
　　將1ml4×

4、104/ml的細胞懸液(原代細胞)接種于六孔板中,血清濃度為5%。細胞接種約24小時后,分實驗組(DES0.01μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.00μg/ml組)、溶劑對照組(DMSO1.00μl/ml)和正常組處理細胞。加藥后不同時間(12h、24h和48h)獲取標(biāo)本,分別用CCK-8、Western Blot和細胞免疫化學(xué)等方法檢測小鼠睪丸引帶細胞中核增殖抗體(PCNA)、雌激素受體(ERα和ERβ)、F-

5、actin和胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞大部分為成纖維樣細胞,有少數(shù)的上皮樣細胞。細胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀走行,胞體呈梭形或不規(guī)則三角形,胞質(zhì)有突起。傳代后細胞仍呈成纖維細胞型生長,同源性好,存活率為85%~90%。
　　2.實驗組細胞隨DES劑量與作用時間生長明顯受抑制,細胞生長緩慢,突起回縮,相互間隙增大,細胞輪廓明顯,胞質(zhì)粗糙,內(nèi)有顆粒堆積,DES劑

6、量越高,細胞越失去成纖維細胞的形態(tài)。
　　3.CCK-8方法發(fā)現(xiàn)正常組細胞呈持續(xù)性增殖,于培養(yǎng)24h后增殖越趨明顯。對照組、0.01μg/ml、0.10μg/ml和1.00μg/ml組增殖趨勢一致,且數(shù)值接近,同一時間段與正常組比較無明顯的差異(P>0.05),而同一組別各時間段與各自12h比較有明顯的差異性(P<0.05)。DES10.00μg/ml組于12h開始持續(xù)呈半數(shù)抑制狀態(tài),與其他各組比較有明顯的差異(P<0.05)。<

7、br>　　4.細胞免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)PCNA嚴(yán)格表達于細胞核中,Western Blot檢測10.00μg/ml組的PCNA表達與其他各組比較有明顯的差異(P<0.05),與CCK-8結(jié)果大致相同。
　　5.細胞免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)睪丸引帶細胞的F-actin在DES作用后發(fā)生明顯的解聚,細胞骨架重塑,細胞周邊肌動蛋白絲帶模糊,應(yīng)力纖維增加,在融合的細胞單層,粗而長的應(yīng)力纖維相互交錯,結(jié)構(gòu)紊亂。且呈劑量和時間相關(guān)性。
　　6.小鼠

8、睪丸引帶細胞負(fù)載Flou-3熒光探針后在激光掃描電鏡下檢測[Ca2+]i,發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)熒光強度呈DES濃度依賴性增強,DES10.00μg/ml組甚至出現(xiàn)胞內(nèi)鈣的熒光強度呈持續(xù)性的高度增強。
　　7.細胞免疫化學(xué)發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸引帶細胞上存在ERα和ERβ,ERα表達于胞核,ERβ既表達于胞核又表達于胞漿。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了小鼠睪丸引帶細胞培養(yǎng)方法。睪丸引帶細胞呈成纖維細胞型生長,傳代后細胞同源性好,存活率高。<

9、br>　　2.DES可導(dǎo)致小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)異常、結(jié)構(gòu)紊亂,且與劑量關(guān)系密切。
　　3. CCK-8和對PCNA的檢測結(jié)果都顯示DES對小鼠睪丸引帶細胞有顯著的細胞毒性作用,呈劑量-時間效應(yīng)。
　　4.F-actin和[Ca2+]i的檢測結(jié)果提示DES可能通過抑制小鼠睪丸引帶細胞的收縮來影響睪丸的正常下降。除經(jīng)典的胞內(nèi)受體介導(dǎo)的信息傳導(dǎo)途徑外,EEs快速影響睪丸引帶細胞內(nèi)各信使的表達還可能通過非基因調(diào)控信號途徑。