結核分枝桿菌抗原Rv3425及融合抗原Ag85B-Rv3425在結核疫苗中的治療和保護作用研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌感染引起的重大傳染性疾病，嚴重威脅人類健康，全球有1/3的人口感染了結核分枝桿菌。近些年來，耐藥結核菌株的出現(xiàn)和HIV感染使得結核病的防治形勢更加嚴峻。目前臨床上應用于治療結核感染的抗結核藥物存在治療周期長，副作用大等諸多問題，導致病人服藥的依從性很低，在一定程度上加劇了結核病的復發(fā)以及耐藥結核的產(chǎn)生;另一方面，人類對于結核病的預防手段目前還只有接種卡介苗BCG一種方式，BCG疫苗對于不同人群的保護效果差異較大，而

2、且對成人幾乎沒有保護效果，所以其保護效果并不理想。因此，探索結核病治療新模式，研發(fā)延長保護時間的新型結核疫苗，成為目前亟待解決的兩大問題。
　　本論文著眼予以上兩大問題，初步探究了新型的解決方案，主要包括以下兩部分:
　　1.慢病毒載體表達結核菌融合抗原Ag85B-Rv3425可以有效治療小鼠結核感染。
　　我們首次將慢病毒作為結核病治療性疫苗的載體，構建相關載體并包裝出可以表達融合抗原Ag85B-Rv3425(簡稱A

3、3)的重組慢病毒，通過小鼠體內(nèi)實驗證明重組慢病毒足墊單次免疫可以有效誘導融合抗原A3在小鼠體內(nèi)表達并激發(fā)相應的免疫反應。小鼠體內(nèi)表達的A3融合抗原經(jīng)過抗原遞呈識別過程，可以刺激特異性的T淋巴細胞增殖，增加小鼠體內(nèi)特異性CD4+，CD8+T淋巴細胞的比例，引發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生針對特異性抗原的Th1型免疫反應，增強Th1型細胞因子IFN-gamma，IL-2的分泌表達，顯示出良好的抗結核潛力。
　　為了檢測重組慢病毒對于結核病的免疫治療效

4、果，我們利用尾靜脈攻毒方式對C57BL/6小鼠進行了結核菌感染，對感染后的小鼠進行免疫治療實驗，治療策略為通過足墊免疫的方式向小鼠體內(nèi)注射重組慢病毒，治療8周后，相對于對照小鼠，經(jīng)過重組慢病毒治療的小鼠肺臟內(nèi)的結核菌量下降了2/3，體重明顯上升，表明重組慢病毒對于感染小鼠體內(nèi)的結核菌具有清除作用，表達融合抗原A3的重組慢病毒表現(xiàn)出良好的結核病免疫治療前景。
　　2.表達融合抗原Ag85B-Rv3425的重組BCG初免，Rv3425

5、蛋白作為亞單位疫苗加強免疫可以取得顯著優(yōu)于BCG的保護效果。
　　為了尋找保護效果優(yōu)于BCG的免疫方案，我們采用了初免-加強的免疫策略，用一株免疫保護效果優(yōu)于BCG的表達融合抗原A3的重組BCG菌株進行初免，分別用重組Ag85B，Rv3425進行兩次加強免疫，借此來尋找最優(yōu)免疫策略。我們發(fā)現(xiàn)，用重組A3-BCG初免，用重組蛋白Rv3425加強的免疫策略可以刺激小鼠脾臟中CD4+T淋巴細胞增殖，提高外周血PBMC中CD19+CD27

6、+記憶型B淋巴細胞的比例，延長免疫反應持續(xù)時間，從而在結核菌入侵時可以有效激發(fā)針對結核菌的特異性免疫反應，對機體提供保護。
　　為了驗證我們的免疫策略對于小鼠有保護作用，我們將免疫后的小鼠通過尾靜脈注射的方式進行攻毒，攻毒后4周和8周分別對小鼠進行肺臟和脾臟菌落計數(shù)。攻毒結果證明，相對于BCG，用重組A3-BCG初免，用重組蛋白Rv3425加強的免疫策略對于小鼠的保護效果更加顯著。A3-BCG/Rv3425免疫策略可以有效降低肺臟