氧化型低密度脂蛋白及阿托伐他汀對人靜脈內皮細胞血管緊張素轉換酶2表達的影響.pdf

1、研究背景: 腎素-血管緊張素系統(reninangiotensinsystem，RAS)在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)形成中起著重要作用，血管緊張素II(angiotensinII，AngII)是系統中的關鍵效應肽，通過誘導炎癥反應及細胞凋亡、促進氧化型低密度脂蛋白攝取、產生氧自由基和影響纖溶功能等多方面參與動脈粥樣硬化的病理過程，阻斷AngII的生物學效應可通過抗高血壓、抗炎、抗增殖和氧化應激等產生強大

2、的抗As作用。研究發(fā)現，AngII與氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL)在As發(fā)生過程中有著協同作用，AngII通過促進低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，LDL)氧化修飾及修飾后LDL攝取，參與As的發(fā)生，而ox-LDL可調節(jié)RAS活性成分表達，增加AngII的生物學效應。 血管緊張素轉換酶2(angiotensin-convertingenzym

3、e2，ACE2)是2000年發(fā)現的RAS新成員，是血管緊張素轉換酶(angiotensin-convertingenzyme，ACE)的同系物，人類ACE的第一個同源基因，在心臟和腎臟血管內皮細胞高表達，主要功能是轉化AngII直接產生血管緊張素(1-7)(angiotensin(1-7)，Ang(1-7))，還可裂解血管緊張素I(angiotensinI，AngI)生成血管緊張素(1-9)(angiotensin(1-9)，Ang(1

4、-9))，Ang(1-9)繼續(xù)被ACE水解為Ang(1-7)。在功能上，ACE2廣泛參與高血壓、心力衰竭、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性肝損傷、急性呼吸窘迫征、妊娠等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。已有研究發(fā)現，血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-convertingenzymeinhibitor，ACEI)能抑制As形成，但在人血管組織中，AngII的生成60％～80％來源于糜酶的作用，ACEI并不能完全阻止AngII生成，而ACE2作

5、為能轉化AngI和直接降解AngII的血管調節(jié)肽酶，能降低局部組織AngII，增加Ang(1-7)濃度，在動脈斑塊內的新生內皮細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞均已發(fā)現ACE2高度表達，分析其具有抗動脈粥樣硬化作用。 他汀類藥物作為降脂藥物，其抗As機制仍是目前研究的熱點，近年來，阿托伐他汀的非調脂作用越來越引起關注。系列臨床研究及實驗證據均發(fā)現他汀類藥物能調節(jié)RAS，通過下調血管緊張素II1型受體(angiotensinIItype1

6、receptor，AT1R)mRNA表達及受體密度，削弱AngII的生物學效應。阿托伐他汀作為最新一代羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxy-methyl-glutarylcoenzymeA，HMG-CoA)還原酶抑制劑，除了具有調脂作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗凝等非調脂作用，從而起到穩(wěn)定斑塊和抗As的目的。 Ox-LDL能與其特異受體-血凝素樣氧化型低密度脂蛋白內皮受體(Lectin-likeOxidizedLowDensity

7、LipoproteinReceptor-1，LOX-1)結合進入血管壁，上調血管平滑肌細胞AT1R及內皮細胞ACE表達等誘導As形成，但其能否通過影響ACE2的表達來調節(jié)RAS活性成分以及阿托伐他汀對該過程有何影響，目前還不十分清楚。針對以上問題，本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)及蛋白質Western印跡法(westernblot)，在細

8、胞生物學水平觀察ox-LDL及阿托伐他汀對培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(humanvascularendothelialcells，HUVECs)ACE2基因和蛋白表達的影響，為臨床防治As提供理論基礎。 目的: 1、觀察ox-LDL在翻譯和轉錄水平對HUVECs表達ACE2的影響。 2、觀察阿托伐他汀對ACE2表達的影響及對ox-LDL的干預作用。 3、探討ox-LDL、阿托伐他汀及內皮細胞ACE2表達三者間

9、是否存在某種聯系及在動脈粥樣硬化形成中的作用機制。 對象和方法: 1.對象: 體外條件培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞。設計：觀察對比實驗。 2方.法: 2.1ox-LDL制備：采用超高速密度梯度離心法從健康人新鮮血液分離出LDL，并將蛋白終濃度調整為500ug/mL，加入終濃度為10mmol/mL的CuSO4溶液中氧化，在濃度為100μmol/L的EDTA溶液中終止氧化。Ox-LDL純度鑒定：用瓊脂糖凝膠

10、電泳法鑒定ox-LDL純度，電泳條帶為單一條帶。Bradford法測定蛋白含量。 2.2阿托伐他汀溶液配制：阿托伐他汀原料藥60.47mg，溶于1ml無水乙醇，加入0.1mol/LNaOH1.5ml，50℃水浴鍋中靜置2h，以0.1mmol/LHC1調pH至7.2，加PBS至總體積5ml，過濾后分裝，-70℃凍存，貯存濃度為10mmol/L。 2.3HUVECs細胞株復蘇、傳代：凍存細胞株復蘇后接種于M199完全培養(yǎng)基(

11、pH7.4，含10％FBS、50ng/L的ECGS、5kU/L肝素、100kU/L青霉素和100mg/L鏈霉素)，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，2-3d后鋪滿培養(yǎng)瓶。0.25％胰蛋白酶進行消化、傳代，取3-6代增殖細胞制成細胞懸液。按2.0×106個細胞/孔的細胞密度接種于6孔板，加含10％FBS的M199培養(yǎng)基置于37℃、5％CO2孵箱中進行培養(yǎng)，待HUVECs生長呈亞融合狀態(tài)時，換以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，分別加

12、入不同濃度ox-LDL及阿托伐他汀刺激。 2.4實驗分組及條件培養(yǎng)(各組均設6個復孔，n=6). 3.統計學方法 數據以均數±標準差(-x±s)表示，多組均數間比較進行方差齊性檢驗和單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。采用SPSS11.5統計軟件對數據進行統計學分析，P≤0.05為差異有統計學意義。 結果: 1.HUVECs鑒定及細胞活力測定： 在倒置顯微鏡下，HUVECs呈單層生長

13、，呈梭形魚貫狀排列或呈多角形鑲嵌排列。VⅢ因子單抗間接免疫熒光染色結果顯示所培養(yǎng)的細胞表達較高密度的Ⅷ因子相關抗原，陽性率為100％，證明所培養(yǎng)的細胞為內皮細胞。臺盼藍染色后細胞記數結果顯示各組HUVECs存活率在96％以上。 2.Ox-LDL對ACE2基因及蛋白表達的影響： 基礎狀態(tài)下，培養(yǎng)的HUVECs即有ACE2mRNA及蛋白表達。不同濃度ox-LDL均顯著下調ACE2基因和蛋白表達(F=57.438，P<0.00

14、1和F=42.299，P<0.001)。與空白對照組比較，各濃度ox-LDL刺激組ACE2mRNA表達量分別降低為空白對照組的73％、51％和33％(均P<0.001)，蛋白表達量降低為空白對照組的81％、50％及32％(P=0.010，P<0.001，P<0.001)，不同濃度組間ACE2mRNA比較差異亦有顯著性(P=0.000，P=0.004，P=0.001)，蛋白表達同樣存在顯著性差異(P=0.000，P=0.014，P=0.0

15、00)。 40mg/Lox-LDL在不同時間均顯著下調ACE2基因和蛋白表達(F=36.483，P<0.001和F=24.985，P<0.001)。于6、12和24h，ACE2mRNA表達量分別降低為空白對照組的66％、56％和50％(均P<0.001)，蛋白表達降低為空白對照組的63％、53％及49％，差異有統計學意義(均P<0.001)。 3.阿托伐他汀對ACE2基因及蛋白表達的影響： 在不同濃度阿托伐他汀刺

16、激組，ACE2mRNA及蛋白表達比較無統計學差異(F=1.566，P=0.299和F=0.867，P=0.474)，不同時間各組差異同樣不存在顯著性(F=1.102，P=0.257和F=0.371，P=0.858))。 4.阿托伐他汀對ox-LDL下調ACE2基因及蛋白表達的干預作用： 阿托伐他汀能抑制ox-LDL對ACE2基因和蛋白表達的下調效應(F=28.199，P<0.001和F=20.321，P<0.001)。1

17、umol/L阿托伐他汀干預組與單純40mg/Lox-LDL對照組比較，ACE2mRNA及蛋白表達沒有顯著性差異(P=0.071和P=0.188)。10umol/L阿托伐他汀干預組與對照組比較，ACE2mRNA及蛋白表達分別增加了1.75、1.69倍，差異均有統計學意義(P<0.001)。高濃度(10umol/L)與低濃度(1umol/L)阿托伐他汀干預組比較，基因及蛋白表達同樣均存在顯著性差異(P<0.001)。 結論: