水通道蛋白4基因缺失對(duì)不同類型腦損傷的影響.pdf

1、研究背景：
　　 水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一組介導(dǎo)水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞膜蛋白，AQP4被認(rèn)為是腦內(nèi)最重要的AQP亞型，主要表達(dá)在包繞腦微血管及蛛網(wǎng)膜的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突膜上，而在非足突的胞體表面表達(dá)較少，與其調(diào)節(jié)水平衡的功能一致。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腦外傷、腦缺血、腦腫瘤等多種腦損傷病理中，伴隨腦內(nèi)AQP4表達(dá)上調(diào)；對(duì)AQP4基因敲除動(dòng)物的研究結(jié)果提示，AQP4對(duì)血管性腦水腫和細(xì)胞性腦水腫的形成均有影響。但是，除了調(diào)節(jié)

2、水平衡外，AQP4還影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)及其他功能，參與非水腫性疾病(如炎癥、興奮性氨基酸毒性等)的病理過程。
　　 腦損傷是高度復(fù)雜的病理過程，可誘發(fā)一系列細(xì)胞及分子事件。在腦損傷的急性期(數(shù)小時(shí)到數(shù)天)，由于代謝紊亂和興奮性毒性導(dǎo)致神經(jīng)元損傷；在亞急性期(數(shù)天到數(shù)周)，主要病變?yōu)檠装Y反應(yīng)和細(xì)胞死亡；在慢性期(數(shù)周以后)，主要為組織修復(fù)等變化。腦損傷中，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞，小膠

3、質(zhì)細(xì)胞激活后對(duì)于腦損傷后炎癥反應(yīng)以及慢性神經(jīng)功能恢復(fù)有重要的影響。腦損傷周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，最終導(dǎo)致膠質(zhì)疤痕的形成，膠質(zhì)疤痕一方面可以限制病變擴(kuò)散，但又阻礙神經(jīng)生長(zhǎng)。
　　 腦損傷后繼發(fā)的炎癥是影響病變程度和恢復(fù)的主要因素之一，受許多炎癥因子、炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)。半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs)是一類重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病發(fā)病中起重要作用。Cys

4、LTs主要通過半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienereceptor，CysLT受體)起作用，該類受體主要包括CysLT1和CysLT2受體兩種亞型。藥理學(xué)表明，CysLT1受體參與腦缺血后急性期神經(jīng)元損傷和慢性期膠質(zhì)增生過程，可誘導(dǎo)血腦屏障通透性增加而參與缺血后炎癥，并能介導(dǎo)粘附因子等的表達(dá)；CysLT2受體介導(dǎo)整體和離體水平缺血性損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和吞噬。
　　 在AQP4基因敲除小鼠，對(duì)腦缺血等損

5、失后腦水腫變化有較多研究，但是，對(duì)于不同類型腦損傷以及炎癥有什么改變，尚無系統(tǒng)研究，尤其需要闡明腦損傷后炎癥變化特點(diǎn)。由于AQP4基因敲除可影響星形膠質(zhì)細(xì)胞功能，由此造成一些非水腫性變化，本研究主要關(guān)注這些方面的變化。
　　 研究目的：
　　 本文采用AQP4基因敲除(AQP4-/-)小鼠，觀察不同類型腦損傷模型中AQP4起的作用，擬做以下4個(gè)方面的研究：
　　 1.闡明局灶性腦缺血后腦內(nèi)炎癥變化特點(diǎn)，觀察缺血損

6、傷后24h和72h炎癥細(xì)胞和炎癥相關(guān)的半胱氨酰白三烯受體，以及其他損傷變化。
　　 2.闡明局灶性腦缺血慢性損傷過程及慢性期改變，觀察缺血損傷后35天內(nèi)的生存率變化，神經(jīng)癥狀以及神經(jīng)元密度和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生的變化。
　　 3.闡明腦冰凍傷后損傷特點(diǎn)，觀察損傷后24h，7天和14天損傷面積和神經(jīng)元密度等變化，以及小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)疤痕形成特點(diǎn)。
　　 4.闡明興奮性氨基酸毒性的變化特點(diǎn)，建立N

7、MDA皮層注射模型，觀察損傷后24h的損傷面積和神經(jīng)元密度以及血腦屏障通透性的的變化。
　　 研究方法：
　　 以線栓法制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)，誘導(dǎo)小鼠局灶性腦缺血模型；以改良的顱骨外冰凍法技術(shù)建立不同時(shí)間點(diǎn)的冰凍傷模型；以大腦皮層微注射技術(shù)，建立NMDA誘導(dǎo)腦興奮性毒性損傷模型。
　　 以冰凍切片甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)腦損傷面積；以冰凍切片IgG免疫組織化學(xué)檢測(cè)法觀察血腦屏障通透性的變化；以冰凍切片免疫

8、熒光組織化學(xué)法，觀察存活神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的的變化；以Fluoro-JadeB染色法觀察壞死神經(jīng)元變化；以免疫印跡法觀察局灶性腦缺血損傷急性期半胱氨酰白三烯受體的表達(dá)特點(diǎn)；免疫熒光共染色法觀察半胱氨酰白三烯受體在腦內(nèi)的細(xì)胞分布。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.AQP4缺失加重腦缺血急性損傷及炎癥反應(yīng)
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠局灶性缺血損傷后24h和72h，周邊區(qū)的神經(jīng)元密

9、度缺失程度增加；缺血后24h和72h中心區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)加重；周邊區(qū)阿米巴樣小膠質(zhì)細(xì)胞活化和增殖增多，但桿狀小膠質(zhì)細(xì)胞的密度減少；同時(shí)，在72h周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生和聚集減弱。AQP4-/-小鼠缺血側(cè)腦組織在缺血后24h和72h，炎癥介質(zhì)受體－半胱氨酰白三烯受體(CysLT1和CysLT2受體)蛋白表達(dá)增加；在兩種小鼠大腦中，CysLT1和CysLT2受體蛋白細(xì)胞定位模式一致，在損傷中心區(qū)都表達(dá)于損傷的神經(jīng)元和中性粒細(xì)胞，在周邊

10、區(qū)都表達(dá)于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，但都不表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。這些結(jié)果提示，AQP4缺失加重急性腦缺血損傷期，加重炎癥反應(yīng)，該變化可能與AQP4-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞功能減弱，限制炎癥的能力下降有關(guān)。
　　 2.AQP4缺失加重腦缺血慢性損傷
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠局灶性腦缺血損傷后35天內(nèi)的生存率降低，術(shù)后的體重恢復(fù)減慢，術(shù)后神經(jīng)癥狀的恢復(fù)減輕；加重腦萎縮體積和腦內(nèi)空洞的形成；并且，抑制損傷周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)

11、胞的反應(yīng)性增生和聚集，減弱膠質(zhì)疤痕的生成。這些結(jié)果提示，AQP4-/-小鼠腦損傷慢性期癥狀加重，可能與腦內(nèi)膠質(zhì)疤痕形成功能減弱，不利于局部限制損傷病灶擴(kuò)展有關(guān)。
　　 3.AQP4缺失減輕腦冰凍傷急性損傷但加重后期損傷
　　 與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠冰凍傷24h腦損傷面積和腦表面出血均明顯減輕；但是，14天的損傷面積增加。損傷周邊區(qū)的神經(jīng)元密度變化與損傷面積類似，與野生型小鼠比較，AQP4-/-小鼠損傷周邊區(qū)

12、在24h的存活神經(jīng)元密度明顯較高，但在7天和14天，則密度明顯降低。同時(shí)，AQP4-/-小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在急性期并沒有明顯的增加或減少，但是，在損傷7天和14天，較野生型小鼠明顯增加。AQP4-/-小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞密度在7天和14天都明顯減少。結(jié)果提示，AQP4基因缺失減輕小鼠腦冰凍傷急性損傷，但是加重延遲性損傷，可能與損傷后期小膠質(zhì)細(xì)胞增生加重有關(guān)。
　　 4.AQP4缺失加重興奮性氨基酸誘導(dǎo)的損傷
　　 小鼠皮層注

13、射NMDA150nmol后24h，可導(dǎo)致皮層損傷、神經(jīng)元變性及血腦屏障通透性增高。與野生型小鼠相比，AQP4-/-小鼠的損傷變化明顯增強(qiáng)。結(jié)果提示，AQP4可能抑制NMDA誘導(dǎo)的急性腦損傷，增加損傷區(qū)Fluoro-JadeB陽(yáng)性的交性神經(jīng)元密度，并且，與抑制血腦屏障通透性增高有關(guān)。結(jié)果提示，AQP4在NMDA誘導(dǎo)的腦損傷中可能起保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.在局灶性腦缺血損傷模型中，AQP4基因缺失可加重缺血性腦損

14、傷。缺血急性期小膠質(zhì)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞聚集增加，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的半胱氨酰白三烯受體表達(dá)。慢性期加重死亡率，減慢小鼠體重增長(zhǎng)，加重腦萎縮體積和腦內(nèi)空洞形成。這些變化可能與AQP4基因缺失減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增生和聚集，減弱膠質(zhì)疤痕的生成有關(guān)。
　　 2.在腦冰凍傷中，AQP4基因缺失小鼠在早期腦表面出血和腦損傷面積減輕；但后期腦損傷加重，這可能與減弱星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，妨礙膠質(zhì)疤痕生成有關(guān)。
　　 3.在興奮性氨基酸損傷模