大鼠油酸性急性肺損傷早期水通道蛋白4在肺水代謝的影響.pdf

1、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(AcuteLungInjury/AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ALA/ARDS)，是臨床常見急性呼吸衰竭的兩個階段，主要表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管屏障破壞，以及肺泡腔內(nèi)高蛋白性水腫。有研究發(fā)現(xiàn)40％的肺損傷患者在插管后12小時(shí)內(nèi)能部分吸收水腫液，說明30％～40％的患者尚存在肺泡上皮細(xì)胞主動清除液體的功能[1]，可作為評價(jià)肺泡上皮完整性和功能的指標(biāo)之一，并與ARDS存活率有明顯

2、相關(guān)。研究早期肺泡上皮細(xì)胞清除功能，對肺水代謝過程中ALI/ARDS的轉(zhuǎn)歸有重要意義。 肺泡II型細(xì)胞雖然只占肺泡表面積5％，但數(shù)量占到了60％，功能有液體轉(zhuǎn)運(yùn)；富含板層小體分泌表面活性物質(zhì)；肺損傷時(shí)增生轉(zhuǎn)化為I型細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)著重研究液體轉(zhuǎn)運(yùn)功能。 II型肺泡上皮細(xì)胞基底側(cè)膜的Na+—K+—ATP酶將鈉離子泵出至間質(zhì)，造成細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度降低，肺泡腔內(nèi)的鈉離子順電勢差經(jīng)上皮鈉通道進(jìn)入細(xì)胞；水分子在滲透壓差的作用下經(jīng)水通

3、道進(jìn)入細(xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。疾病早期肺水腫的肺泡II型細(xì)胞肺泡水重吸收是修復(fù)肺損傷的修復(fù)關(guān)鍵一步。 水通道在滲透性水通透中起易化作用，使水通過生物膜的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過彌散速度。但在病理損傷的情況下，尤其是早期水通道蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分明確，基于已認(rèn)識到水通道蛋白具有主動吸收水的作用，也已證實(shí)肺組織中存在1、3、4、5、8、9水通道蛋白等6種水通道[2]。但在肺損傷后，水通道蛋白在肺水腫時(shí)如何變化尚未研究。 因此，我們選擇了在

4、肺泡細(xì)胞中具有“干細(xì)胞”作用、又廣泛覆蓋于肺泡表面直接面對肺泡液體的肺泡II型細(xì)胞作為靶目標(biāo)。前期的工作證明肺泡II型細(xì)胞也存在AQP1，并明確了各通道在細(xì)胞膜上的分布部位；目前以AQP4為主要研究對象，在液體清除中各發(fā)揮何種作用，在正常、肺損傷早期及β2受體激動劑藥物治療后是否有通道的表達(dá)變化，檢測血管外肺水(EVLW)明確肺水腫形成和清除之間液體量差，是否可以早期使用β2受體激動劑，肺水腫減輕程度，為臨床治療篩選藥物探索應(yīng)用指針和效

5、果提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 研究方法： 健康Sprague—Dawley大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，體重190～230克。按隨機(jī)數(shù)字表法將動物分為3組，對照組、油酸制ALI/ARDS肺損傷模型組、β2受體激動劑特布他林氣道治療組，每組20只大鼠，共60只。實(shí)驗(yàn)步驟大致如下： 油酸ALI/ARDS模型的建立：油酸是一種具有較強(qiáng)毒性的飽和脂肪酸，進(jìn)入機(jī)體后會對肺組織誘發(fā)并擴(kuò)大氧化性肺損傷。是目前公認(rèn)較好的AR

6、DS模型，(3)腹腔靜脈注射油酸0.1ml/kg，30分鐘后放血活殺。通過下一步實(shí)驗(yàn)HE病理染色、動脈血?dú)夥治?、EVLW判斷大鼠肺損傷的程度，模型是否成功建立。 ATII細(xì)胞的分離、純化和鑒定[4]采用改良的胰酶消化法分離肺泡II型上皮細(xì)胞，用大鼠IgG免疫粘附法純化細(xì)胞，臺盼蘭測細(xì)胞活力，改良的鞣酸染色法和透射電鏡鑒定細(xì)胞純度。 EVLW的測定：重力法測定EVLW[5]。在靜水壓和膠體滲透壓綜合作用下，滲出的液體減去淋

7、巴管轉(zhuǎn)移入血管的部分為血管外肺水。根據(jù)公式計(jì)算EVLW含量。 大鼠肺泡組織AQP—4免疫組化染色[6]。AQP—4在肺泡II型上皮細(xì)胞m—RNA表達(dá)的測定：Trizol提取總RNA，紫外線分光光度儀OD260檢測其含量。逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)檢測AQP—4mRNA的表達(dá)。采用Strom860圖像分析系統(tǒng)行密度掃描，計(jì)算AQP4產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP4mRNA表達(dá)水平。 研究結(jié)果

8、： 1.動物ALI/ARDS模型的成功建立經(jīng)腹腔靜脈注入油酸0.1ml/kg后，所有大鼠均在30s-3min內(nèi)出現(xiàn)明顯呼吸加快，淺促，口唇皮膚以及四肢發(fā)紺，氣管插管內(nèi)分泌物明顯增多的臨床表現(xiàn)。氣管插管直接呼吸空氣情況下，PaCO2明顯上升，PaO2/FiO2值符合ALI/ARDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對照組肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)無水腫、炎癥，肺泡相對干燥。油酸組可見肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有小量出血，可見炎性細(xì)胞增多；肺泡隔增寬，肺間質(zhì)滲液明顯，腎上腺素能

9、β2受體激動劑氣管給藥組肺組織損傷評分介于兩者之間。 2.大鼠ATII細(xì)胞的分離純化方法是可行的，經(jīng)臺盼蘭染色對照組細(xì)胞活力84.3±3.21％，油酸組83.7±2.96％(圖10-11)，電鏡下見細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，呈圓形或立方形，表面有很多長短不一的微絨毛，核圓形，胞質(zhì)著色淺，呈泡沫狀。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含許多線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和溶酶體；并可見特征性的嗜鋨性板層小體(圖12)。電鏡下見細(xì)胞變性、凋亡甚至崩解，細(xì)胞形態(tài)相對不規(guī)

10、則，表面的微絨毛明顯減少，胞核變形，染色質(zhì)邊集，線粒體腫脹，胞漿內(nèi)各種細(xì)胞器明顯減少，板層小體排空顯著增多而致空泡化并可見到脫落的板層小體(圖13、14)；特布他林組細(xì)胞形態(tài)相對較規(guī)則，板層小體略有釋放，線粒體等細(xì)胞器無明顯變化(圖22)。 3.EVLW的含量損傷模型組明顯高于加藥組和對照組，肺水腫形成和清除之間液體量差最小為對照組，加藥組差值小于模型組，說明在肺損傷早期，就已經(jīng)存在明顯肺泡毛細(xì)血管大量滲出，滲出大于重吸收和間質(zhì)

11、回流，給藥組明顯提高肺泡上皮液體清除能力。 4.正常大鼠肺泡組織AQP4免疫組化染色，正常組AQP4呈弱陽性染色，細(xì)胞偶被染成淡黃色(圖25、26)，主要分布肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)較園的細(xì)胞上，在模型組AQP4呈陽性染色，棕黃陽性顆粒增多、染色強(qiáng)度變大(圖27、28)，加藥組呈強(qiáng)陽性表現(xiàn)(圖29、30)。經(jīng)過RT—PCR擴(kuò)增后，AQP4產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物吸光度積分的比例，作為AQP4的m—RNA表達(dá)水平，以加藥組合成明顯增加，其

12、次為模型組，說明ATII細(xì)胞核內(nèi)合成AQP4的m—RNA是增加，加藥組可刺激表達(dá)增強(qiáng)(見圖31、32)。 結(jié)論： 1.采用改良的胰酶消化法可以成功分離正常和油酸ARDS大鼠的ATII細(xì)胞，用大鼠IgG包被培養(yǎng)皿純化細(xì)胞、鞣酸染色法鑒定細(xì)胞純度簡單可行，而透射電鏡是鑒定細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。 2.經(jīng)腹腔靜脈注射油酸建立大鼠ARDS急性模型是一個相對簡單而成功率高的方法，大鼠血PaO2顯著下降，PaCO2顯著上升，肺部出現(xiàn)明

13、顯病理改變，上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯壞死早期的表現(xiàn)，血?dú)夥治?、光鏡下肺損傷評分及EVLW油酸組嚴(yán)重程度顯著高于對照組，顯微鏡下肺泡II型上皮細(xì)胞的數(shù)量較對照組無明顯減少，但電鏡下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)如板層小體排空，線粒體損傷，符合肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 3.氣道內(nèi)特布他林給藥，從肺臟大體紅色、血?dú)夥治?、病理、肺泡II型上皮細(xì)胞電鏡下形態(tài)等結(jié)果達(dá)不到肺損傷的標(biāo)準(zhǔn)，肺毛細(xì)血管滲透性下降，間質(zhì)水腫減輕，肺泡上皮細(xì)胞主動重吸