丹參對(duì)酒精和Tat蛋白損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　應(yīng)用酒精和Tat蛋白制作PC12細(xì)胞和鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察丹參配方顆粒和丹參有效成分對(duì)酒精及Tat蛋白損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，探討酒精、Tat蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷及丹參保護(hù)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;酶標(biāo)法檢測(cè)PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性;Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化;應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)和Annexin V/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞儀檢

2、測(cè)PC12細(xì)胞凋亡情況;相關(guān)試劑盒測(cè)定超氧化物歧化酶(T-SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶(GSH-PX)的活性和丙二醛(MDA)的量;DCFH-DA染色法檢測(cè)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;Western-blotting法檢測(cè)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變;TUNEL法檢測(cè)腦片神經(jīng)細(xì)胞凋亡;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞突觸前體蛋白突觸素?cái)?shù)量的變化;DiI金顆粒散射標(biāo)記對(duì)樹(shù)突棘進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果:
　　

3、酒精對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。不同濃度的丹參配方顆粒對(duì)PC12細(xì)胞存活率影響不顯著(P＞0.05)，但用丹參溶液作用于800mmol/L濃度酒精損傷的PC12細(xì)胞時(shí)，0.2μg/ml的丹參溶液能夠顯著減少細(xì)胞損傷，這種保護(hù)作用在一定濃度范圍內(nèi)(0.2-1.0μg/ml)隨丹參濃度的增加而增強(qiáng)(P＜0.05)，說(shuō)明丹參對(duì)酒精所致PC12細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。酒精損傷造成PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)

4、染色質(zhì)凝聚，核固縮，DNA片段化，而后出現(xiàn)凋亡小體;TUNEL和Annexin V/PI標(biāo)記染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示800mmol/L酒精處理24h后細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比明顯高(P＜0.01);細(xì)胞氧化-抗氧化相關(guān)物質(zhì)或酶發(fā)生變化，ROS、MDA含量明顯升高，抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX活性明顯降低(P＜0.01)。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示800mmol/L酒精處理后細(xì)胞BAX蛋白相對(duì)表達(dá)量增加、Casp

5、ase-3出現(xiàn)活性片段蛋白相對(duì)表達(dá)量增加、BCL-2蛋白相對(duì)表達(dá)量下降(P＜0.01)。同時(shí)加入1μg/ml丹參配方顆粒后與酒精處理組相比，細(xì)胞MDA含量和ROS水平降低，細(xì)胞抗氧化酶T-SOD、CAT和GSH-PX酶的活性升高(P＜0.01);且細(xì)胞BAX蛋白相對(duì)表達(dá)量減少、Caspase-3兩活性片段蛋白相對(duì)表達(dá)量減少、BCL-2蛋白相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0.01）。鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)酒精處理4d后出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡(P＜0.01)，

6、神經(jīng)細(xì)胞突觸素和樹(shù)突棘數(shù)量明顯減少(P＜0.01)，同時(shí)加入1μg/ml丹參配方顆粒后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少（P＜0.01），且細(xì)胞突觸素和樹(shù)突棘數(shù)量與酒精處理組相比明顯增加（P＜0.01）。
　　Tat蛋白對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性(P＜0.05)，不同濃度的丹酚酸A對(duì)PC12細(xì)胞存活率影響不顯著（P＞0.05），但用丹參溶液、丹酚酸A作用于0.16μmol/L濃度Tat蛋白損傷的PC12細(xì)胞時(shí)，丹參溶液和

7、丹酚酸A均能夠顯著減少細(xì)胞損傷(P＜0.05)，說(shuō)明丹參和丹酚酸A對(duì)Tat所致PC12細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。鼠腦片神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)Tat蛋白處理4d后出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，Tat蛋白損傷引起腦片神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突棘數(shù)量減少(P＜0.01)，同時(shí)加入丹參配方顆粒、丹酚酸A后腦片神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少（P＜0.01），且神經(jīng)細(xì)胞樹(shù)突棘數(shù)量顯著增多(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　(1)丹參配方顆粒對(duì)酒精誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和鼠腦片神經(jīng)細(xì)