KLF5和hhLIM協(xié)同激活苯腎上腺素誘導的心肌肥大標志基因表達.pdf

1、目的:心肌肥大是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心臟病等負荷性心臟病的并發(fā)癥,是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應,也是導致頑固性心衰的主要原因。目前,導致心肌肥厚的病理機制尚不完全清楚。
　　 LIM蛋白是一類富含半胱氨酸且分子結構中具有一個或多個鋅指結構的蛋白質家族,該家族成員廣泛參與多種細胞的發(fā)育與分化調節(jié)及多種基因的轉錄調控。hhLIM又稱為hLIM3(GenBank AF121260),是用三元遞減法從人胎

2、心cDNA文庫中篩選克隆的一個與心臟生長發(fā)育有關的新基因,因其編碼產(chǎn)物與LIM蛋白家族高度同源且氨基酸序列中含有典型的LIM結構域而得名。我們以前的研究已經(jīng)證實,hhLIM是一種漿/核穿梭蛋白,在分化型細胞中,該蛋白主要分布于胞質中,通過與α-actin相互作用,誘導α-actin纖絲組裝形成粗大的肌束結構,維持心肌的收縮功能。當心肌細胞受肥大因素刺激時,胞漿中的hhLIM進入細胞核內,通過與Nkx2.5相互作用,協(xié)同激活BNP和α-a

3、ctin等細胞肥大相關基因的表達。
　　 Krüppel樣因子(Krüppel-like factor,KLF)是一類含鋅指結構的轉錄因子家族,主要參與調節(jié)細胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程。KLF家族中的KLF5(又稱BTEB2)是心血管重塑過程中的重要轉錄因子,在心肌肥大過程中扮演著重要角色。
　　 雖然已經(jīng)證明hhLIM和KLF5均參與心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程,但二者在心肌肥大過程中的相互關系及功能聯(lián)系尚不清楚。本研

4、究探討hhLIM與KLF5在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用,為揭示心肌肥厚的發(fā)生機制提供新的研究證據(jù)。
　　 方法:用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞;MTT法檢測苯腎上腺素(PE)對細胞增殖的影響;流式細胞分析術分析細胞周期各時相的分布情況;用Western blot分析檢測KLF5、hhLIM、Nkx2.5和心鈉素(ANT)表達;GST pull-down和免疫共沉淀分析法檢測KLF5與hhLIM之間的相互作用;報告

5、基因分析檢測KLF5和hhLIM對ANF基因表達的影響。
　　 結果:
　　 1)PE促進原代心肌細胞肥大
　　 PE(20μmol/L)作用于原代培養(yǎng)的心肌細胞48 h后,心肌細胞體積較對照組相比明顯增大。RT-PCR和Western blot結果顯示,PE可顯著誘導心肌肥大標志基因ANF和Nkx2.5表達,說明PE誘導心肌肥大的細胞模型復制成功。
　　 2)PE誘導KLF5和hhLIM表達
　　

6、 不同濃度的PE刺激心肌細胞相同時間以及相同濃度的PE作用于細胞不同時間后,KLF5和hhLIM的表達呈劑量和時間依賴性的增加。說明KLF5和hhLIM參與PE誘導心肌肥大的發(fā)生過程。
　　 3)KLF5與hhLIM協(xié)同激活ANF基因的表達
　　 采用脂質體介導法將ANF啟動子指導的報告基因質粒與hhLIM/KLF5表達質粒及內參照質粒共轉染293A細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)定量分析啟動子的活性。結果顯示,在

7、293A細胞中,單獨過表達hhLIM或KLF5,均可增強報告基因的表達活性,而hhLIM和KLF5表達質粒共轉染細胞時,報告基因的表達活性比其單獨轉染時顯著升高,熒光素酶活性達對照組的2.48倍。上述結果表明,KLF5與hhLIM可以協(xié)同激活ANT基因的表達。
　　 構建hhLIM和KLF5腺病毒表達載體,轉染心肌細胞,Western blot結果顯示,過表達hhLIM和KLF5可以顯著誘導心肌肥大標志基因ANF的表達,表明hh

8、LIM和KLF5可以協(xié)同誘導心肌肥大的發(fā)生。
　　 4)PE促進KLF5與hhLIM的相互作用
　　 上述實驗結果顯示,KLF5和hhLIM協(xié)同激活ANF基因的表達。為揭示二者協(xié)同作用的分子機制,我們進行免疫共沉淀和GST pull-down實驗。結果顯示,在PE刺激前后的原代心肌細胞和H9C2心肌細胞中,均可檢出KLF5與hhLIM相互作用,PE刺激后兩者之間的結合顯著增加,提示KLF5與hhLIM之問存在物理學上的相

9、互作用,PE能夠促進二者之間的相互締合。
　　 5)敲低KLF5取消PE對ANF表達的誘導作用
　　 我們以往的實驗證實,hhLIM是一種輔轉錄因子,因此,我們推測hhIIM激活ANF表達可能是通過與KLF5相互作用實現(xiàn)的。為了證實這一推測,將大鼠KLF5特異性小干擾RNA(KLF5-siRNA)導入大鼠H9C2心肌細胞,敲低PE誘導的內源性KLF5表達后,檢測ANF的表達變化。結果顯示,KLF5-siRNA轉染的細胞與