1、目的：選擇p21為靶基因，研究KLF5和c-Jun在p21基因轉(zhuǎn)錄激活中的作用及其調(diào)節(jié)方式，從而揭示二者在p21基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中扮演的角色及相互關(guān)系。
方法：用Western blot分析檢測(cè)KLF5、c-Jun和p21表達(dá)以及不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化變化；免疫共沉淀檢查KLF5與c-Jun之間的相互作用；報(bào)告基因分析檢測(cè)KLF5和c-Jun對(duì)p21基因表達(dá)的影響；細(xì)胞免疫熒光染色觀察KLF5在細(xì)胞分布中的定位；流式細(xì)胞
2、光度術(shù)分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況。
結(jié)果：⑴流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ于作用VSMC6、12、24 h后，G1期細(xì)胞數(shù)量減少，S期細(xì)胞數(shù)量增加，表明VSMC在AngⅡ作用下增殖活性明顯升高。提示，AngⅡ可加快VSMC細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)VSMC增殖；⑵Western blot結(jié)果顯示，100 nM AngⅡ刺激VSMC不同時(shí)間和不同濃度AngⅡ刺激細(xì)胞12 h，KLF5和c-Jun的表達(dá)水平呈劑量和時(shí)
3、間依賴性的增高。而p21的表達(dá)水平則呈時(shí)間和劑量依賴性降低，提示AngⅡ?qū)SMC的促增殖效應(yīng)涉及到了KLF5、c-Jun和p21。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，在靜止的VSMC中，KLF5在胞漿和胞核均有分布。AngⅡ刺激6 h后，KLF5出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位。刺激12、24 h的細(xì)胞，KLF5幾乎完全定位于細(xì)胞核中。報(bào)告基因結(jié)果證明，在293A細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)KLF5可顯著抑制p21啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)活性；⑶AngⅡ可以誘導(dǎo)KLF5和c-Ju
4、n表達(dá)，為揭示二者在抑制p21基因表達(dá)中的作用及其機(jī)制，用免疫共沉淀檢測(cè)二者的相互作用。結(jié)果表明，AngⅡ刺激1h后，KLF5和c-Jun之間的結(jié)合顯著增加，提示，KLF5與c-Jun之間存在物理學(xué)上的相互作用，AngⅡ能夠誘導(dǎo)二者之間的相互締合。用報(bào)告基因分析檢查KLF5與c-Jun相互作用對(duì)p21基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)過(guò)表達(dá)c-Jun或KLF5，均可顯著抑制報(bào)告基因的表達(dá)活性，c-Jun和KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因的
5、表達(dá)活性比其單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)進(jìn)一步降低；⑷AngⅡ作用于VSMC0.5 h，KLF5的磷酸化水平顯著增高，1 h達(dá)到高峰，3 h仍維持在較高水平。用Western blot檢測(cè)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，AngⅡ可誘導(dǎo)MEK和ERK1/2快速磷酸化。上述結(jié)果顯示，AngⅡ可通過(guò)誘導(dǎo)KLF5磷酸化而促進(jìn)KLF5與c-Jun之間的相互作用；⑸AngⅡ誘導(dǎo)的KLF5磷酸化與ERK1/2信號(hào)通路激活有關(guān)，用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理VS
6、MC2 h后，再用AngⅡ刺激細(xì)胞不同時(shí)間。免疫沉淀結(jié)果顯示，用50μM PD98059預(yù)處理VSMC后，再用AngⅡ刺激，與AngⅡ刺激組相比，KLF5磷酸化水平顯著降低。轉(zhuǎn)染持續(xù)活化型MEK表達(dá)質(zhì)粒pCMV-MEK1后，KLF5磷酸化水平顯著升高。從正反兩方面證明，AngⅡ誘導(dǎo)KLF5磷酸化活化與ERK1/2通路激活有關(guān)。交互免疫共沉淀結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，PD98059抑制KLF5和c-Jun之間的相互作用。上述結(jié)果進(jìn)一步證明，AngⅡ
7、通過(guò)激活ERK1/2通路發(fā)生KLF5磷酸化；⑹用c-Jun和KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，可顯著抑制p21啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)活性。當(dāng)c-Jun、KLF5和MEK三種表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，對(duì)p21啟動(dòng)子的抑制作用更加明顯，在這種情況下，報(bào)告基因表達(dá)活性僅為對(duì)照組的5％；如在c-Jun和KLF5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前用PD98059預(yù)處理細(xì)胞，則p21啟動(dòng)子活性恢復(fù)到對(duì)照組水平。該結(jié)果表明，AngⅡ通過(guò)ERK1/2通路抑制p21啟動(dòng)子活性。<