IVM對小鼠卵母細(xì)胞ESET和H3K9Me3表達(dá)影響研究.pdf

1、背景:哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)成熟(in-vitro maturation,IVM)聯(lián)合體外受精(in-vitro fertilization,IVF)和體外胚胎培養(yǎng)(in-vitro embryo culture,IVC)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及人類不育的臨床治療。IVM技術(shù)是指直接從卵巢中取得未成熟卵母細(xì)胞,在體外培養(yǎng)至第二次減數(shù)分裂中期(metaphaseⅡstage of meiosis,MⅡ)。卵母細(xì)胞IVM應(yīng)用于臨床有

2、以下幾個(gè)重要原因:(1)可以避免卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS);(2)IVM聯(lián)合卵巢或卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)可以為接受癌癥化療的婦女提供妊娠機(jī)會(huì);(3)可以解決目前臨床上誘導(dǎo)排卵方案存在的許多問題,如高昂的醫(yī)療費(fèi)用以及激素刺激所帶來的副反應(yīng)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn),IVM技術(shù)較傳統(tǒng)的體外受精(IVF)技術(shù)容易被患者接受。許多不育機(jī)構(gòu)嘗試運(yùn)用IVM技術(shù)治療病人,但是IVM的成功率明顯低于

3、IVF。在卵子形成過程中,卵母細(xì)胞與其周圍的體細(xì)胞存在著交互對話。諸如營養(yǎng)物質(zhì)、激素的變化以及環(huán)境混合物等因素均可對卵子的質(zhì)量和后續(xù)的胚胎生長產(chǎn)生重大的影響。體外培養(yǎng)成熟組的卵母細(xì)胞是在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中發(fā)育,由于缺乏體內(nèi)完善的自我調(diào)控系統(tǒng),模擬環(huán)境的穩(wěn)定性不及體內(nèi);其次,培養(yǎng)過程中的體外操作步驟不可避免地將卵母細(xì)胞暴露于變化的環(huán)境中,如室溫、可見光光線等;它們有可能對卵母細(xì)胞發(fā)育造成影響?；蚪MDNA及其表觀遺傳學(xué)修飾等眾多的分子生物

4、學(xué)機(jī)制共同調(diào)控哺乳動(dòng)物的生長。在哺乳動(dòng)物的生殖、發(fā)育或疾病的某些特殊時(shí)期,細(xì)胞會(huì)通過染色質(zhì)DNA甲基化水平改變,組蛋白尾部修飾,非組蛋白的結(jié)合,染色質(zhì)重塑,有序地調(diào)整基因表達(dá),其過程不涉及DNA堿基序列改變,稱為表遺傳修飾重新編程。表遺傳標(biāo)志是可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳的。基因激活/失活的精確時(shí)間點(diǎn)對正常的植入前胚胎發(fā)育至關(guān)重要,任何表達(dá)的延遲或缺失都會(huì)導(dǎo)致異常。因此,重新編程需獲得激活的正確時(shí)間點(diǎn)和基因表達(dá)的完好的排列方式,以啟動(dòng)

5、和繼續(xù)受精之后的胚胎發(fā)育。卵子有效阻止多精受精的能力明顯地受成熟度的影響。卵母細(xì)胞具有重組進(jìn)入其內(nèi)精子染色體的功能,使之轉(zhuǎn)變?yōu)樾墼?pronucleus,PN),并參與全部染色體甲基化和乙?；谋磉z傳重組過程。體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞易出現(xiàn)紡錘體和染色體的異常,表觀遺傳重新編程能力的下降,這些異常可能與受精率低有關(guān)。染色質(zhì)的基本單位為核小體,核小體由四種組蛋白(H2A、H2B、H3、H4)各兩分子構(gòu)成的八聚體和纏繞其上的DNA所構(gòu)成。組

6、蛋白翻譯完成后,其氨基尾巴會(huì)發(fā)生多種共價(jià)修飾,如乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化等,這些修飾方式共同構(gòu)成了“組蛋白密碼”。核心組蛋白的修飾影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。在基因沉默相關(guān)的各種組蛋白修飾中,最典型的是組蛋白去乙?；图谆?。甲基化是組蛋白各種修飾中最復(fù)雜的修飾方式,甲基位點(diǎn)可以是賴氨酸(lysine,K)殘基和精氨酸(argine,Arg)殘基,與轉(zhuǎn)錄激活和抑制都相關(guān)。H3K9的甲基化可招募HP1(heterochromat

7、in proteins)或其同源物與之結(jié)合,從而使基因所在部位異染色質(zhì)化,這表明,組蛋白的甲基化可能與異染色質(zhì)的形成有關(guān),并且調(diào)控著個(gè)別基因的表達(dá)。H3K9Me3(histone H3lysine9 tri-methylation)參與異染色質(zhì)的形成和維持,使基因表達(dá)沉默。組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferases,HMTs)完成的?；蚧钚詥?dòng)子募集H3K9Me3特異甲基化轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致異染色

8、質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄抑制。ESET(ERG-associated protein with SET domain)是一種組蛋白H3K9三甲基轉(zhuǎn)移酶,它通過特異性三甲基化組蛋白H3K9,行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控和隨后的局部染色質(zhì)修飾的功能,進(jìn)而導(dǎo)致基因沉默并參與異染色質(zhì)的維持。作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT),ESET可能與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的其他染色質(zhì)重塑酶組成復(fù)合物。ESET/SETDB1是催化H3K9Me3的唯一常染色質(zhì)HMT。眾多研究表明,體外操作的各

9、個(gè)環(huán)節(jié)及培養(yǎng)環(huán)境均可能影響卵母細(xì)胞的生長發(fā)育,影響表觀遺傳重新編程。組蛋白修飾參與染色體類型的轉(zhuǎn)變,調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長發(fā)育。H3K9Me3和ESET在卵母細(xì)胞的表觀遺傳重新編程,卵母細(xì)胞形成過程中基因轉(zhuǎn)錄及成熟后的受精中都有重要作用。通過對IVM卵母細(xì)胞的研究,可以揭示外部因素對卵母細(xì)胞生長發(fā)育的影響、組蛋白修飾、表觀遺傳重新編程的作用并為IVM技術(shù)的安全性提供理論支持。但是至今還未見關(guān)于IVM卵母細(xì)胞H3K9Me3和ESET表達(dá)的研究

10、。因此,我們采用機(jī)械方法獲取小鼠GV期卵母細(xì)胞,在體外培養(yǎng)成熟,測量IVM卵母細(xì)胞的直徑,通過RT-PCR方法檢測ESET基因mRNA水平,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法檢測IVM卵母細(xì)胞ESET和H3K9Me3蛋白表達(dá),并與體內(nèi)成熟組進(jìn)行比較。研究目的觀察小鼠經(jīng)體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞的體積、ESET基因mRNA水平、ESET和H3K9Me3蛋白表達(dá),比較它們在IVM卵母細(xì)胞與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞之間的差異,探討外部因素對卵母細(xì)胞生長發(fā)育和組蛋白修

11、飾的作用并為IVM技術(shù)的安全性提供理論支持。材料方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR品系雌性小鼠2.實(shí)驗(yàn)分組2.1 IVM組ICR品系雌性小鼠經(jīng)孕馬血清促性腺激素(pregnant mareserum gonadotropin,PMSG)超促排卵46～48h后,頸椎脫臼法處死,采用針剝法撕破雙側(cè)卵巢取GV期卵母細(xì)胞。在MHTF中漂洗一遍,轉(zhuǎn)移至含有激素(rFSH0.075IU/ml,hCG0.5IU/ml)的HTF培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)14～16h

12、后,從培養(yǎng)系統(tǒng)中收集成熟卵母細(xì)胞(MⅡ期)。2.2體內(nèi)組ICR品系雌性小鼠經(jīng)PMSG超促排卵46～48h后,注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG),注射HCG后13～15h頸椎法脫臼法處死。用注射器刺破輸卵管膨大部,獲取卵母細(xì)胞-放射冠-卵丘細(xì)胞復(fù)合物(oocyte-conora-cumulus complexes,OCCs),透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞5～10min,獲取MⅡ期裸卵。3.

13、利用MacBiophotonics Image J軟件測量卵母細(xì)胞直徑。4.以18S RNA為參照,RT-PCR擴(kuò)增兩組卵母細(xì)胞ESET的mRNA,利用KODAK EDAS290凝膠成像系統(tǒng)軟件比較兩組中ESET的mRNA的相對表達(dá)量。5.熒光免疫細(xì)胞化學(xué)法同時(shí)檢測ESET和H3K9Me3的蛋白的分布,并應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡(ZEISS LSM510)成像系統(tǒng)的附帶軟件對ESET和H3K9Me3熒光灰度值進(jìn)行差異比較。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

14、計(jì)算卵母細(xì)胞ESETmRNA/18S RNA比值及ESET和H3K9Me3熒光灰度值,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包,行Independent-sample T Test檢驗(yàn)分析,P<0.05為有顯著性差異。結(jié)果:1.IVM卵母細(xì)胞的發(fā)育GV期卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)14～16h后,成熟率為78.61％。實(shí)驗(yàn)中選取的IVM卵母細(xì)胞,直徑平均為(75.03±2.98)um,體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞,直徑平均為(95.77±4.03)um(p<0.01

15、)。2.RT-PCR結(jié)果ESET mRNA相對表達(dá)量在兩組間無顯著性差異(P>0.05)。3.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果3.1無論在IVM組還是在體內(nèi)組,MⅡ期卵母細(xì)胞均有明顯的ESET蛋白表達(dá)。表達(dá)分布特點(diǎn)均為:卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)的均勻表達(dá),卵母細(xì)胞周邊皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)增強(qiáng)。卵母細(xì)胞ESET蛋白免疫熒光染色強(qiáng)度灰度值比較發(fā)現(xiàn)IVM組顯著低于體內(nèi)組(P=0.007)。3.2 H3K9Me3蛋白在MⅡ期卵母細(xì)胞表達(dá)模式在兩組間無差異,均與DAPI的位置重合

16、,存在于卵母細(xì)胞和極體的染色體上。極體染色體的熒光強(qiáng)度顯著高于卵母細(xì)胞染色體的熒光強(qiáng)度(P>0.05)。結(jié)論1.IVM過程影響卵母細(xì)胞的生長發(fā)育,IVM卵母細(xì)胞的直徑小于體內(nèi)成熟組的。2.ESET蛋白在MⅡ期卵母細(xì)胞表達(dá),表達(dá)分布特點(diǎn)均為:卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)的均勻表達(dá),卵母細(xì)胞周邊皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)增強(qiáng)。IVM過程雖未影響ESET基因的轉(zhuǎn)錄,卻能影響ESET蛋白質(zhì)的表達(dá)量。3.甲基化的H3K9—H3K9Me3只表達(dá)于MⅡ期卵母細(xì)胞的染色質(zhì)/染色體