小鼠合子中DNAL甲基化和H3K9me2修飾的變化及調(diào)控機制研究.pdf

1、表觀遺傳變化是指細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息外的其它可遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，即基因型未發(fā)生改變而表型卻發(fā)生了變化，且這種變化在發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳機制是哺乳動物正常發(fā)育和維持組織特異性基因表達(dá)模式所必需的。其中，染色質(zhì)中組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾和DNA自身的甲基化是基因組表觀修飾的兩個主要機制，并且這兩種機制存在相互作用和影響。近年來深入研究表觀遺傳機制、不同機制之間的相互作用和表觀遺傳變化成為熱點。而在小鼠合子發(fā)育階段存在著眾多表觀

2、遺傳修飾的變化，包括雌雄原核DNA甲基化和多種組蛋白修飾的不對稱現(xiàn)象，因此是一個很好的研究表觀遺傳機制的模型。本論文選取了研究比較多、機制較清楚的DNA甲基化和組蛋白H3K9me2修飾作為研究對象，對其在合子發(fā)育期間的變化和調(diào)控機制進(jìn)行了研究和探索。
　　 1.小鼠合子期DNA甲基化的變化及其調(diào)控機制研究
　　 發(fā)育過程中DNA甲基化變化的事件已有深入的研究。父源基因組的主動去甲基化發(fā)生在受精后的合子早期，接著在分裂期發(fā)

3、生被動去甲基化，而在囊胚期發(fā)生重新甲基化。父源基因組在胚胎發(fā)育早期處于低甲基化水平。然而，本文的研究提供了直接和間接的證據(jù)，表明在小鼠胚胎發(fā)育的第一次細(xì)胞周期期間父源基因組發(fā)生了基因組水平的新生DNA甲基化。通過進(jìn)一步對二細(xì)胞初期之前每隔兩小時的各個階段DNA甲基化的水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在合子末期的雄原核發(fā)生了低水平的新生DNA甲基化，而在第一次有絲分裂中期父源基因組發(fā)生了全基因組水平的新生DNA甲基化。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入Aphidicol

4、in或Cycloheximide時，體外受精24h后雌雄原核仍不消失，而雄原核的DNA甲基化水平仍然很低。這表明第一次有絲分裂中原核核膜的消失有助于新生DNA甲基化的發(fā)生。
　　 通過檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt3A和Dnmt3L)的定位，發(fā)現(xiàn)Dnmt3A和Dnmt3L在體外受精14h時明顯的定位于雄原核內(nèi)。另外，在合子晚期的雄原核異染色質(zhì)區(qū)檢測到明顯的甲基化信號。對比于H4K20三甲基化在雌雄原核上的分布，表明合子中父母源基

5、因組的異染色質(zhì)表觀遺傳修飾標(biāo)記是不同的。
　　 2.小鼠合子期H3K9me2修飾變化及其調(diào)控機制研究
　　 以前的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠受精卵雌、雄原核組蛋白H3K9甲基化修飾不對稱，雌原核甲基化，而雄原核檢測不到組蛋白H3K9甲基化修飾;然而在受精后抑制蛋白質(zhì)合成，在IVF12h的受精卵雄原核中出現(xiàn)明顯的H3K9甲基化修飾。這項研究表明，受精卵雄原核新生組蛋白H3K9甲基化依賴于受精后新生基因組轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。本文對小鼠

6、合子不同發(fā)育階段H3K9me2修飾進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠合子雄原核在IVF10h及以后檢測到低水平的H3K9me2修飾。這說明在小鼠合子階段存在著兩個不同的調(diào)控機制調(diào)控雄原核的H3K9me2修飾。IVF8h之前的階段不依賴于新生蛋白的合成，而是存在某種機制抑制了組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的進(jìn)入雄原核。IVF8h后的階段依賴于新生蛋白的合成。在IVF8-10h期間是這兩種調(diào)控機制的轉(zhuǎn)換階段，新生蛋白合成需要時間，不能及時抑制甲基轉(zhuǎn)移酶活性，因此會導(dǎo)致低

7、程度H3K9me2的發(fā)生。本實驗使用了對小鼠合子進(jìn)行處理，然后檢測小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾的變化。結(jié)果說明，抑制DNA復(fù)制和抑制細(xì)胞周期蛋白及其依賴性激酶，都不會改變小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾。即DNA復(fù)制過程和細(xì)胞周期調(diào)控過程可能都沒有參與調(diào)控小鼠合子雄原核的H3K9me2修飾。
　　 經(jīng)過注射G9A抗體和mRNA實驗，去除和過表達(dá)G9A都對H3K9me2修飾產(chǎn)生了影響，進(jìn)一步證明了G9A參與調(diào)控了H3K9m

8、e2不對稱修飾修飾，是Cycloheximide處理后引起小鼠合子階段雄原核H3K9me2的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。本實驗還檢測了GLP的定位情況，同時進(jìn)行了小鼠合子顯微注射GLP抗體，檢驗GLP抗體對小鼠合子H3K9me2修飾的影響。表明GLP在小鼠合子早期就已進(jìn)入雌雄原核定位，Cycloheximide處理可能增加了GLP的入核，但GLP分布無雌雄原核不對稱性，提示GLP可能不參與小鼠合子雄原核H3K9me2修飾的調(diào)控機制。