醫(yī)用臭氧對(duì)慢性乙型病毒性肝炎患者細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是最嚴(yán)重和最普遍的健康問題之一，全世界約有20億人受累。盡管從1982年開始使用HBV疫苗后，HBV感染率大為下降，全世界至今仍有超過3．5億的慢性HBV攜帶者，其中約75％分布于亞太平洋地區(qū)。隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，HBV感染者發(fā)生肝臟功能失代償、肝硬化、肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)亦逐漸增加，全世界每年約有50-120萬人死于HBV感染相關(guān)的終末期肝病。我國(guó)約有1．2億HBV感染者，其中20

2、00-3000萬為慢性活動(dòng)性肝病患者。因此，慢性HBV感染依然是一個(gè)具挑戰(zhàn)性的全球健康問題。 HBV感染的結(jié)局與宿主的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，其中機(jī)體對(duì)HBV的免疫耐受而導(dǎo)致特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）應(yīng)答不足是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因。慢性HBV感染的免疫學(xué)特點(diǎn)主要有：①存在不同程度的免疫耐受。HBV感染病例外周血中有大量病毒抗原，血液高濃度的病毒抗原長(zhǎng)期刺激，可能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的Treg細(xì)胞，PD-1及CTLA-4等免疫抑

3、制分子表達(dá)上調(diào)，從而使病毒特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)低下或缺失。②抗原提呈細(xì)胞特別是樹突狀細(xì)胞（DC）數(shù)量較少或功能缺陷，影響DC-T細(xì)胞間的相互作用，致使HBV抗原特異性T細(xì)胞HLA-Ⅱ表達(dá)下降，導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答減弱、增殖不足，不能激活Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、或不能激活CTL的細(xì)胞毒活性；③HBV特異性TCR CDR3譜型較窄或峰形偏倚，T細(xì)胞呈單克隆性或寡克隆性增生，從而使機(jī)體對(duì)HBV抗原的識(shí)別及應(yīng)答譜較窄；④Ⅰ型及Ⅱ型輔助性T淋巴細(xì)胞（Hel

4、per T lymphocyte，Th）失平衡。在病毒復(fù)制部位T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子型可能影響感染的最后結(jié)局，特異性Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于清除病毒；而Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，雖然有利于產(chǎn)生針對(duì)HBV的抗體，但容易使感染慢性化。慢性HBV感染者Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2等）相對(duì)不足，而Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-10等）水平相對(duì)較高，因而維持慢性感染狀態(tài)。⑤抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子（TNF-α及

5、IFN-γ等）可能存在基因突變、基因多態(tài)性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的異常。 隨著對(duì)乙型肝炎病毒學(xué)、免疫學(xué)及慢性感染自然史認(rèn)識(shí)的提高，目前公認(rèn)HBV復(fù)制是免疫介導(dǎo)肝損傷和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)者。自1998年以來，一些有效的口服抗病毒藥物的批準(zhǔn)使用使乙型肝炎的治療發(fā)生了革命性的變化。目前批準(zhǔn)用于抗HBV治療的藥物分兩大類，注射用的干擾素（普通干擾素和長(zhǎng)效干擾素）及口服的核苷（酸）類似物（拉米夫定、阿德福韋、替比夫定和恩替卡韋等）。這些藥物可有效

6、的抑制病毒復(fù)制和阻止疾病進(jìn)展，但卻不能完全清除病毒；核苷（酸）類似物長(zhǎng)期治療的耐藥問題也是一個(gè)很大的缺陷。因此，我們需要尋找新的藥物或治療策略來提高慢性乙型肝炎治療的效果。 近年，醫(yī)用臭氧用于治療乙型病毒性肝炎成為一種新的探索。醫(yī)用臭氧是臭氧與醫(yī)用純氧的混合氣體，可用于治療風(fēng)濕、潰瘍性結(jié)腸炎、椎間盤突出癥等多種疾病。臭氧作用全血后產(chǎn)生活性氧（ROS，主要是H2O2）和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（LOPs），這兩種產(chǎn)物分別作用于血液中的各種成

7、分（單核細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞）及內(nèi)皮細(xì)胞和其他器官，產(chǎn)生各種效應(yīng)，近年來過氧化氫（H2O2）被認(rèn)為是動(dòng)、植物細(xì)胞中一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信使，因此臭氧是通過其反應(yīng)產(chǎn)物間接發(fā)揮作用。中國(guó)大陸在2004年底開始臭氧治療乙型病毒性肝炎的嘗試并且初見療效，醫(yī)用臭氧有望成為治療慢性乙型肝炎的一種新的策略。但其作用機(jī)制不清楚。既往研究推斷醫(yī)用臭氧具有免疫調(diào)節(jié)作用，但尚需進(jìn)一步證實(shí)，因此，研究醫(yī)用臭氧的免疫作用機(jī)制具有重要的臨床意義。 目的

8、: 通過研究醫(yī)用臭氧體外對(duì)慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分泌細(xì)胞因子功能的影響， 1．探索臭氧治療CHB的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)理； 2．為醫(yī)用臭氧治療CHB提供基礎(chǔ)研究的證據(jù)，促進(jìn)并推廣其在臨床上的應(yīng)用； 3．為CHB的治療尋找新策略，提高治療效果。 方法: 1．酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)臭氧作用后CHB患者PBMC培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4水平：分別采集

9、11例CHB患者和8例健康獻(xiàn)血員外周血10ml，密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸后，以不同濃度（4、10、20、40、80μg/mL，）的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后，于37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)；設(shè)置醫(yī)用純氧（O2，冒泡法作用）、陽性（PHA10μg/ml刺激）、陰性（RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基）及雙復(fù)孔自身對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，ELISA檢測(cè)各處理組PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ和IL-4的濃度，

10、操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。 2．流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)臭氧作用后CHB患者CD4+和CD8+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-4陽性細(xì)胞的比例：分別采集8例CHB患者和6例健康獻(xiàn)血員外周血10ml，密度梯度離心法分離PBMC，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸后，以不同濃度（4、10、20、40、80μg/mL）的醫(yī)用臭氧冒泡法作用后，于37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)，加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑（Brefeldin A，終濃度1

11、0μg/ml），于37℃含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)；設(shè)置醫(yī)用純氧（O2，冒泡法作用）、陽性（PHA10μg/ml刺激）、陰性（RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基）對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，用不同熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞表面分子CD4及CD8進(jìn)行染色，固定破膜后用IFN-γ及IL-4熒光抗體對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行染色。用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞中IFN-γ及IL-4陽性細(xì)胞的百分率，并用CellQuest軟件分析結(jié)果。

12、 3．統(tǒng)計(jì)分析：本研究采用2×8析因設(shè)計(jì)，即比較兩組人群（CHB患者和健康志愿者）分別接受8種不同處理（5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和3個(gè)對(duì)照組）的差異。兩組人群之間及8種不同處理組之間整體差異的比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析；兩組人群內(nèi)部各處理組整體差異的比較用單因素方差分析；兩組人群之間各個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；同一組人群各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<

13、0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果: 1．兩組人群陽性對(duì)照組IFN-γ及IL-4濃度及CD8+和CD4+陽性細(xì)胞的比例均顯著高于其他處理組（P<0．05）。 2．CHB患者PBMC經(jīng)過臭氧處理后分泌IFN-γ濃度的整體水平顯著高于健康志愿者（F=12．097，P=0．001），而IL-4的整體水平略低于健康志愿者，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1．822，P=0．179）。兩人群組內(nèi)不同臭氧濃度處理IFN-γ及IL-4濃度的

14、整體水平均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0．05），低濃度（4μg/mL、40μg/mL）臭氧可輕微刺激IFN-γ和IL-4的分泌，而高濃度（40μg/mL、80μg/mL）臭氧則有抑制作用。 3．CHB患者CD8+細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞的比例顯著高于健康對(duì)照組（F=5．101，P=0．026），CD4+細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞比例均數(shù)高于健康對(duì)照組（陽性對(duì)照組除外），但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0．034，P=0．845），CHB患者及健康

15、人群組各臭氧處理組間CD8+細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞的比例均有顯著差異（P=0．001及P=0．043），兩組人群各臭氧處理組間CD4+細(xì)胞中IFN-γ陽性細(xì)胞的比例均無顯著差異（P>0．05）。兩組人群間CD8+及CD4+細(xì)胞IL-4陽性細(xì)胞比例總體水平無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0．05），平均水平高低亦無明顯趨勢(shì)。CHB患者各臭氧處理組間CD8+及CD4+細(xì)胞中IL-4陽性細(xì)胞的比例均無顯著差異（P>0．05），健康人群組各臭氧處理組間

16、CD8+及CD4+細(xì)胞中IL-4陽性細(xì)胞的比例均有顯著差異（P=0．019及P=0．009）。隨著醫(yī)用臭氧濃度的升高IFN-γ及IL-4陽性細(xì)胞的比例逐漸降低，可見低濃度醫(yī)用臭氧對(duì)PBMC有輕微刺激作用，而高濃度時(shí)則抑制PBMC分泌細(xì)胞因子。 結(jié)論: 1．臭氧體外作用對(duì)CHB患者PBMC分泌細(xì)胞因子的功能有影響，可促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子（IFN-γ）表達(dá)，而對(duì)Th2型細(xì)胞因子（IL-4）的表達(dá)無顯著作用。 2．臭氧