Celecoxib對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞中HPV18E6mRNA及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：用環(huán)氧化酶2抑制劑Celecoxib干預(yù)宮頸癌HeLa細(xì)胞株后，觀察HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡情況，研究其中HPVE6和COX2基因表達(dá)的變化，初步研究HPV與COX2的相關(guān)性。 方法：用不同濃度Celecoxib干預(yù)HeLa細(xì)胞株24h后：(1)采用HPV18E6單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)HPV18E6蛋白的表達(dá)變化； (2)四唑氮藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響；(3)流式細(xì)胞

2、儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況；(4)Hoechst33258染色觀察Hela細(xì)胞在形態(tài)學(xué)的變化；(5)RT-PCR檢測(cè)HPVl8E6及COX2mRNA表達(dá)的改變。 結(jié)果：(1)HeLa細(xì)胞中HPVl8E6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)染色陽(yáng)性著色顆粒位于細(xì)胞漿，部分位于胞核，均可見(jiàn)深棕褐色顆粒，表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)組終濃度分別為10 μ mol／L、20 μ mol／L、40μmol／L、80 μmol／L的Celecoxib作用于HeLa細(xì)胞2

3、4h后，其胞質(zhì)內(nèi)E6蛋白表達(dá)明顯下降，著色細(xì)胞變淡變少，隨著濃度增加表達(dá)由陽(yáng)性漸變?yōu)殛幮?，?duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為100％、72％、49％、9％、0％，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)率經(jīng)卡方檢驗(yàn)相比較差異顯著(X<'2>=27.858 P<0.05)。 (2)經(jīng)終濃度分別為10 μ mol／L、20 μ mol／L、40 μ mol／L、80μmol／L、160 μmol／L Celecoxib處理HeLa細(xì)胞24h后，M

4、TT檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力分別為對(duì)照組細(xì)胞活力(A490值)的87.06％±1.72％、46.99％±2.42％、11.92％±1.15％、6.48％±1.35％、2.08％+0.62％，與對(duì)照組比較有明顯差異(F=2659.17 P(0.05)。在一定濃度范圍內(nèi)隨著Celecoxib濃度的增加，對(duì)HeLa細(xì)胞抑制率顯著增加，呈量效關(guān)系(相關(guān)度比較R=-0.777 P(0.05)。 (3)Hoechst33258熒光染色顯

5、示經(jīng)20μmol／L Celecoxi作用Hela細(xì)胞24h后表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小，細(xì)胞漿密度增大、顏色變深，染色質(zhì)致密固縮聚集于細(xì)胞核，核膜呈境界分明的塊狀或新月形小體，有凋亡小體形成及核裂解。 (4)流式細(xì)胞儀顯示各實(shí)驗(yàn)組Celecoxib(終濃度分別為10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L)作用Hela細(xì)胞24h后對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為2.42％±0.41％、9.56％±1.71

6、％、21.52％±1.95％、30.59％±2.12％、36.34％±2.12％，各濃度組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組之間有顯著差異(F=187.3 P<0.05)，并且呈劑量依賴性(R=0.919 P<0.05)。 (5)凝膠圖像分析儀分析RT-PCR產(chǎn)物：實(shí)驗(yàn)組Celecoxib(終濃度分別為10 u mol／L、20 u mol／L、40 u mol／L、80 u mol／L)作用Hela細(xì)胞24h前后，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HP

7、Vl8E6mRNA／β—actin及COX2mRNA／β—actin分別0.59±0.01、0.40±0.2、0.34±0.02、0.06±0.03、0.04±0.01；0.58±0.02、0.41±0.02、0.17±0.01、0.06±0.01、0.03±0.02，隨著Celecoxib濃度的升高，其表達(dá)隨之下降，經(jīng)方差分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間差異具有顯著性(F<,(HPY)>=434.05 F<,(cox2)>=505.18均P<0