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文檔簡介
1、目的:用環(huán)氧化酶2抑制劑Celecoxib干預(yù)宮頸癌HeLa細(xì)胞株后,觀察HeLa細(xì)胞生長、增殖、凋亡情況,研究其中HPVE6和COX2基因表達(dá)的變化,初步研究HPV與COX2的相關(guān)性。 方法:用不同濃度Celecoxib干預(yù)HeLa細(xì)胞株24h后:(1)采用HPV18E6單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測HPV18E6蛋白的表達(dá)變化; (2)四唑氮藍(lán)(MTT)比色法檢測其對細(xì)胞增殖的影響;(3)流式細(xì)胞
2、儀測定細(xì)胞凋亡情況;(4)Hoechst33258染色觀察Hela細(xì)胞在形態(tài)學(xué)的變化;(5)RT-PCR檢測HPVl8E6及COX2mRNA表達(dá)的改變。 結(jié)果:(1)HeLa細(xì)胞中HPVl8E6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測染色陽性著色顆粒位于細(xì)胞漿,部分位于胞核,均可見深棕褐色顆粒,表達(dá)呈強(qiáng)陽性。實(shí)驗(yàn)組終濃度分別為10 μ mol/L、20 μ mol/L、40μmol/L、80 μmol/L的Celecoxib作用于HeLa細(xì)胞2
3、4h后,其胞質(zhì)內(nèi)E6蛋白表達(dá)明顯下降,著色細(xì)胞變淡變少,隨著濃度增加表達(dá)由陽性漸變?yōu)殛幮裕瑢φ战M與實(shí)驗(yàn)組的陽性表達(dá)率分別為100%、72%、49%、9%、0%,實(shí)驗(yàn)組與對照組的表達(dá)率經(jīng)卡方檢驗(yàn)相比較差異顯著(X<'2>=27.858 P<0.05)。 (2)經(jīng)終濃度分別為10 μ mol/L、20 μ mol/L、40 μ mol/L、80μmol/L、160 μmol/L Celecoxib處理HeLa細(xì)胞24h后,M
4、TT檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力分別為對照組細(xì)胞活力(A490值)的87.06%±1.72%、46.99%±2.42%、11.92%±1.15%、6.48%±1.35%、2.08%+0.62%,與對照組比較有明顯差異(F=2659.17 P(0.05)。在一定濃度范圍內(nèi)隨著Celecoxib濃度的增加,對HeLa細(xì)胞抑制率顯著增加,呈量效關(guān)系(相關(guān)度比較R=-0.777 P(0.05)。 (3)Hoechst33258熒光染色顯
5、示經(jīng)20μmol/L Celecoxi作用Hela細(xì)胞24h后表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小,細(xì)胞漿密度增大、顏色變深,染色質(zhì)致密固縮聚集于細(xì)胞核,核膜呈境界分明的塊狀或新月形小體,有凋亡小體形成及核裂解。 (4)流式細(xì)胞儀顯示各實(shí)驗(yàn)組Celecoxib(終濃度分別為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)作用Hela細(xì)胞24h后對照組和各實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為2.42%±0.41%、9.56%±1.71
6、%、21.52%±1.95%、30.59%±2.12%、36.34%±2.12%,各濃度組細(xì)胞凋亡率與對照組之間有顯著差異(F=187.3 P<0.05),并且呈劑量依賴性(R=0.919 P<0.05)。 (5)凝膠圖像分析儀分析RT-PCR產(chǎn)物:實(shí)驗(yàn)組Celecoxib(終濃度分別為10 u mol/L、20 u mol/L、40 u mol/L、80 u mol/L)作用Hela細(xì)胞24h前后,各實(shí)驗(yàn)組和對照組HP
7、Vl8E6mRNA/β—actin及COX2mRNA/β—actin分別0.59±0.01、0.40±0.2、0.34±0.02、0.06±0.03、0.04±0.01;0.58±0.02、0.41±0.02、0.17±0.01、0.06±0.01、0.03±0.02,隨著Celecoxib濃度的升高,其表達(dá)隨之下降,經(jīng)方差分析對照組和實(shí)驗(yàn)組之間差異具有顯著性(F<,(HPY)>=434.05 F<,(cox2)>=505.18均P<0
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