基因組DNA及GSTP1基因甲基化修飾與燃煤污染型砷中毒關(guān)系探討.pdf

1、1研究背景：
　　砷是環(huán)境中普遍存在的一種類金屬元素，是明確的人類致癌物。環(huán)境砷污染可導(dǎo)致慢性砷中毒乃至癌癥的發(fā)生,其所造成的公眾危害已成為全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。慢性砷中毒對人體的危害極為嚴(yán)重,可導(dǎo)致皮膚癌、肺癌、肝癌、膀胱癌等的高發(fā)，砷的中毒機(jī)制至今尚不明了。燃煤污染型地方性砷中毒(以下簡稱燃煤型砷中毒)是一種因燃用高砷煤和長期攝取受高砷煤污染的食物而引起的一種地方性砷中毒，嚴(yán)重威脅著群眾健康，其致病、致癌機(jī)制一直是該領(lǐng)域的研

2、究重點(diǎn)。
　　近年來，表觀遺傳學(xué)(epigenetics)已成為生命科學(xué)中普遍關(guān)注的前沿學(xué)科。環(huán)境化學(xué)致癌因素引起的DNA序列以外的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制逐漸引起了人們的廣泛關(guān)注，特別是DNA甲基化，它是腫瘤中最常見的分子改變形式之一，可導(dǎo)致基因表達(dá)水平的變化，促進(jìn)腫瘤形成。多種化學(xué)毒物可引起基因組低甲基化和特定基因的高甲基化，即異常甲基化，其在疾病形成上起著重要的作用。砷中毒與基因組DNA甲基化改變、特定基因甲基化改變是否有著密切聯(lián)

3、系呢？本研究在既往基礎(chǔ)上，選擇谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）這一重要的解毒基因及全基因組DNA進(jìn)行甲基化的表觀遺傳學(xué)研究。
　　谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）是一重要的解毒基因、DNA損傷修復(fù)基因，參與代謝、解毒和消除潛在的具有基因毒性的外來化合物，它能夠代謝多種致癌化合物，起到保護(hù)細(xì)胞、避免DNA損傷和癌細(xì)胞形成的作用，抑制GSTP1活性可以導(dǎo)致DNA損傷的敏感性增強(qiáng)和癌變發(fā)生的機(jī)率增加。本研究對我省燃煤污染型砷暴露

4、病區(qū)人群的DNA甲基化（基因組 DNA甲基化、GSTP1基因甲基化）、mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)三個水平探討砷致病的DNA異常甲基化表觀遺傳機(jī)制，為砷中毒及砷致癌表觀遺傳生物學(xué)標(biāo)志的篩選和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2研究對象與方法：
　　2.1調(diào)查點(diǎn)及研究對象
　　貴州省興仁縣交樂鄉(xiāng)燃煤污染型砷中毒病區(qū)，按地方性砷中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS/T211-2001），選擇123例砷中毒患者（輕度42例、中度41例，重度40例），在距病區(qū)

5、約13 km的非砷暴露村，選擇47例居民作為對照組。在知情同意原則下，采集被調(diào)查者的外周血進(jìn)行DNA甲基化(基因組DNA甲基化及GSTP1基因甲基化)及mRNA的檢測。此外收集自愿接受手術(shù)治療的53例砷中毒患者皮膚組織標(biāo)本(一般病變28例、癌前病變20例，癌變5例)和15例正常皮膚組織標(biāo)本，檢測GSTP1蛋白表達(dá)。
　　2.2研究方法
　　2.2.1砷中毒患者基因組DNA甲基化調(diào)控采用高效液相色譜法檢測砷中毒患者外周血基因組

6、DNA甲基化調(diào)控；
　　2.2.2砷中毒患者GSTP1基因DNA甲基化調(diào)控采用甲基化特異性PCR檢測砷中毒患者外周血GSTP1基因DNA甲基化調(diào)控；
　　2.2.3砷中毒患者GSTP1基因mRNA轉(zhuǎn)錄采用實(shí)時熒光定量PCR檢測砷中毒患者外周血GSTP1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；
　　2.2.4砷中毒患者GSTP1蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)法檢測GSTP1蛋白在皮膚組織中的表達(dá)。
　　3結(jié)果：
　　3.1砷中毒患者基

7、因組DNA甲基化較對照組人群降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　全基因組DNA甲基化水平砷中毒組人群（13.36±6.32）％較對照組人群（19.70±7.23）%降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。中、重砷中毒組外周血基因組DNA甲基化水平分別為（8.74±4.65%、13.72±5.73%），與對照（19.70±7.23）%比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；輕度砷中毒組外周血基因組DNA甲基化水平（17.53±5.23%）與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

8、　　3.2砷中毒患者GSTP1基因DNA高甲基化，與對照組人群存在差異
　　砷中毒患者按病情分組，輕、中、重度砷中毒組患者外周血GSTP1基因DNA甲基化陽性率分別為28.57%、57.10%和65.00%，與對照組（6.38%）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；按皮膚病理診斷分組，一般病變組（（包括色素增多、皮炎和角化過度等）、癌前病變組（包括不典型增生、皮角及經(jīng)久不愈潰瘍）和癌變組（包括Bowen’s病、基底細(xì)胞癌和鱗狀上皮細(xì)胞癌）患者G

9、STP1基因DNA甲基化陽性率分別為21.43%、50.00%和80.00%，與對照組（6.67%）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；GSTP1基因DNA甲基化陽性率隨砷中毒患者病情及皮膚病理損害程度加重而升高。
　　3.3砷中毒患者GSTP1mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，且GSTP1基因DNA高甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄。
　　GSTP1mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，輕度砷中毒組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中度、重度砷中毒組顯著低于對照組及輕度砷中毒組，重度砷

10、中毒組低于中度砷中毒組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義; GSTP1 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，一般病變組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），癌前病變組和癌變組轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著低于對照組及一般病變組（P<0.01），癌變組亦顯著低于癌前病變組（P<0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。將砷中毒組及對照組按GSTP1基因DNA甲基化檢測結(jié)果分為甲基化組和非甲基化組，甲基化組的GSTP1 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著低于非甲基化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

11、
　　3.4砷中毒患者GSTP1蛋白表達(dá)下調(diào)，GSTP1基因DNA高甲基化抑制其蛋白表達(dá)。
　　GSTP1蛋白在正常皮膚組織中表達(dá)，陽性染色僅見于細(xì)胞漿。對砷中毒患者按病情分組分析發(fā)現(xiàn)，輕、中、重度砷中毒組GSTP1蛋白陽性表達(dá)率分別為89.29%、65.00%、40.00%,對照組GSTP1蛋白陽性表達(dá)率為100.00%，隨著砷中毒患者皮膚病害程度加重，GSTP1蛋白表達(dá)逐漸減弱。按GSTP1基因DNA甲基化檢測結(jié)果分為甲

12、基化組和非甲基化組，兩組GSTP1蛋白陽性表達(dá)率分別為57.14%、95.75%，甲基化組低于非甲基化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4結(jié)論：
　　4.1砷中毒患者基因組DNA甲基化水平低于對照組人群，提示基因組DNA甲基化降低與砷中毒的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　4.2燃煤砷污染可能通過導(dǎo)致人體 GSTP1基因啟動子區(qū)高甲基化，進(jìn)而抑制其mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白表達(dá)，GSTP1基因在砷致病或致癌過程中起重要作用。
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