脂肪酸合成酶在大鼠骨外膜組織中表達的研究.pdf

1、目的：雌激素是影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一個重要因素，在青春期雌激素抑制骨外膜成骨；而在絕經(jīng)后雌激素缺乏時骨外膜下成骨增強，以補償骨量丟失所致骨強度的降低，給予雌激素則進一步增強骨外膜成骨。雌激素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用有可能通過骨外膜這個靶點產(chǎn)生，其在基因水平的機制還遠未闡明。本課題組已經(jīng)構(gòu)建了17β—雌二醇作用前后人骨外膜來源的成骨細胞差異表達基因文庫，本研究在此基礎(chǔ)上驗證篩選其中的基因，獲得17β—雌二醇影響的基因——脂肪酸合成酶基因

2、，并在雌性SD大鼠中進一步探討生長發(fā)育階段、雌激素影響在體骨外膜組織中該基因的表達水平、相應(yīng)蛋白的組織定位，及與骨組織形態(tài)學(xué)及骨量的相關(guān)關(guān)系。 方法： 1、篩選驗證。 分離入骨外膜來源的成骨細胞，進行體外原代培養(yǎng)和鑒定，提取雌激素處理組和對照組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。針對差減庫中重復(fù)次數(shù)大于10次的22個基因，設(shè)計相應(yīng)的PCR引物。首先采用半定量PCR辦法進行篩選，繼而采用實時熒光定量PCR法(re

3、al-TimePCR)對篩選結(jié)果進一步驗證。選擇表達差異最顯著的基因——脂肪酸合成酶基因(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)在大鼠中進一步研究。 2、動物實驗。 分三部分： (1)FAS基因在不同發(fā)育階段的大鼠骨外膜組織中表達的變化：分別選取初生5天、3個月、9個月、16個月齡SD雌性大鼠各10只。 (2)FAS基因在大鼠去勢前后表達的變化：6個月齡大鼠共30只，按體重隨機分為3組，卵巢切除

4、組(OVX)、對照組、假去勢組(Sham)，每組各10只。 (3)FAS基因在大鼠動情周期不同階段中表達的變化：采用陰道涂片法，分別選取3月齡動情前期、動情期、動情后期、動情間期大鼠各10只。 上述各部分中的動物在處死前測量活體腰椎、股骨、全身骨密度、全身體成分含量及分布；處死后收集其血清，測定雌二醇、孕酮水平(化學(xué)發(fā)光法)；剝除顱骨骨膜組織，提取骨膜組織RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，半定量PCR法檢測各組基因表達的水平；對左

5、股骨分析股骨骨形態(tài)計量各項參數(shù)；對右股骨及骨膜組織免疫組織化學(xué)法分析骨膜組織基因蛋白的表達情況。 結(jié)果： (一)、半定量PCR驗證篩選出的基因共有7個，分別為cytochrome P450，family 1，subfamily B，polypeptide 1(CYP1B1)；non_metastatic cells4(NME4)；cathepsin B(CTSB)：beta_1，3_glucuronyltransfera

6、se 3(glucuronosyltransferaseI)(B3GAT3)；protein kinase N1(PKN1)；thrombospondin 1(THBS1)；脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)。后三個基因在實時熒光定量PCR中進一步得到驗證。 (二)、FAS基因表達的變化。 1、不同發(fā)育階段大鼠： (1)、骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達水平：初生大鼠組>16月齡>9月

7、齡>3月齡，分別為3.38±3.74，3.04±1.07，1.51±1.32，0.52±0.34。3月齡組與新生鼠組、16月齡組差異有顯著性(p=0.0110)。 (2)、免疫組化顯示在各組大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶的表達呈陽性，且以骨膜纖維層為主；但只有在初生大鼠骨外膜中呈強陽性，且以骨膜形成層為主。 2、OVX組、Sham組、對照組大鼠：6月齡手術(shù)，取材時9月齡。 (1)、血清雌二醇水平(pg/ml)：sh

8、am組>對照組>OVX組，分別為20.81±12.62，17.64±4.35，13.47±1.84。 (2)、OVX組大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達的水平顯著高于sham組和對照組，分別為3.09±1.97，1.33±0.47，1.51±1.32。(p=0.0372) (3)、免疫組化顯示各組大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶的表達均呈陽性，以骨膜纖維層為主。 3、動情周期不同階段大鼠：為3月齡大鼠。 (

9、1)、血清雌二醇水平(pg/ml)：P組(動情前期)>E組(動情期)>D組(動情間期)>M組(動情后期)，分別為36.11±24.45，24.49±19.46，22.95±7.94，14.78±2.49。動情前期組與動情后期組有顯著差異。(p=0.0270) (2)、骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達水平：動情后期組>動情前期組>動情間期組>動情期組，分別為3.06±1.10，1.17±1.10，0.94±0.33，0.75±0.

10、65。動情后期組與其他三組差異有顯著性。(p=0.0001) (3)、免疫組化顯示各組大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶的表達均呈陽性，以骨膜纖維層為主。 4、3月齡、9月齡、16月齡大鼠骨形態(tài)計量學(xué)結(jié)果：9月齡及16月齡骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因的表達水平與骨形態(tài)計量參數(shù)中的骨小梁面積(r=-0.44018，P=0.0025)、骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(r=-0.44018，P=0.0025)、骨小梁數(shù)量(r=-0.62069，p

11、=0.0001.)呈負相關(guān)，而與骨小梁分離度呈正相關(guān)(r=0.57075，p=0.0001)。 5、3月齡、9月齡、16月齡大鼠骨密度結(jié)果：3月齡骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達水平與腰椎骨密度(r=-0.37122，p=0.0398)全身骨密度(r=-0.35998，p=0.0467)負相關(guān)。 結(jié)論： 1、雌二醇處理后引起人骨外膜細胞中多個基因表達的變化。 2、雌二醇抑制體外培養(yǎng)的人骨外膜細胞中脂肪酸合

12、成酶基因的表達。 3、雌二醇抑制大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因的表達。 4、3月齡大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達水平與骨密度呈負相關(guān)，與脂肪含量無關(guān)。 5、9月齡及16月齡大鼠骨外膜組織中脂肪酸合成酶基因表達水平與骨量負相關(guān)，與骨小梁結(jié)構(gòu)不佳正相關(guān)。 6、免疫組化顯示脂肪酸合成酶在初生鼠骨外膜組織中表達強陽性，表達部位以骨膜的形成層為主；其余成年大鼠脂肪酸合成酶在骨外膜組織中表達陽性，表達部位以骨