淫羊藿素通過抑制脂肪酸合成酶活性誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制.pdf

1、研究背景： 淫羊藿苷(icariin，ICA，一種黃酮醇糖苷)分子量為676，是箭葉淫羊藿的主要成分。淫羊藿素(icaritin，ICT)分子量為368，是ICA的3種代謝產(chǎn)物之一，也屬于黃酮類化合物。已有多項實驗表明，黃酮類化合物，如茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯、毛地黃黃酮、櫟皮黃酮、山奈酚等，均具有抑制腫瘤生長的作用。雖然有關(guān)淫羊藿苷抗腫瘤活性的研究已有較多報道，但目前對淫羊藿素與腫瘤關(guān)系的研究僅局限于其通過擬雌激素樣作用

2、促進雌激素受體陽性癌細胞增殖。 在對上述黃酮類化合物的研究中發(fā)現(xiàn)它們具有一個共同的作用靶點--脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)。FAS是1994年Kuhajda等[1]發(fā)現(xiàn)的一種癌基因抗原-519，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其終產(chǎn)物為軟脂酸(palmitic acid，PA)。后者作為組成細胞膜脂的基礎(chǔ)物質(zhì)，其含量的多寡直接影響著細胞增殖的速度。在正常情況下，F(xiàn)AS除在肝臟中高表達參與脂類物質(zhì)的合成外，

3、在其他人體組織中含量很低。腫瘤細胞FAS表達增高順應了腫瘤細胞無限生長的特性，為腫瘤細胞的生長增殖提供了原料[2]。 人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是腫瘤細胞過表達的另一個基因。HER2為酪氨酸激酶受體，屬于erbB家族，與上皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)非常相似，參與調(diào)節(jié)細胞的生

4、長與分化[3]。HER2在多種腫瘤細胞中都有表達，HER2過表達可使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，并與腫瘤患者的預后不良有關(guān)。近來的研究發(fā)現(xiàn)[4]，F(xiàn)AS和HER2在某些癌細胞中有同時過表達的現(xiàn)象。不論是對FAS進行藥物抑制還是基因沉默都可抑制HER2表達，而HER2過表達也可使FAS表達增高，表明FAS和HER2之間具有雙向調(diào)節(jié)的機制。 本課題致力于挖掘淫羊藿素作為傳統(tǒng)中草藥活性分子單體的新的藥用價值，研究淫羊藿素抑制腫瘤細胞

5、生長，促進腫瘤細胞凋亡的作用及其分子機制，初步評價淫羊藿素作為抗腫瘤藥物的應用潛能。主要研究內(nèi)容包括：(1)淫羊藿素誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制的實驗；(2)淫羊藿素誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制的分子機制研究。 研究方法： 一、淫羊藿素誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制的實驗 我們的預試驗結(jié)果顯示，微量淫羊藿素對雌激素受體陽性細胞具有生長刺激作用，但較高濃度的淫羊藿素可誘導雌激素受體陰性腫瘤細胞凋亡，而誘導雌激素受體陽性腫瘤

6、細胞凋亡的敏感性則較差。在對多個細胞株篩選試驗后，本文選擇具有代表性的雌激素受體陰性腫瘤細胞株SK-Br-3乳腺癌細胞和LnCap前列腺癌細胞(均高表達FAS和HER2)，以及MCF-10a正常乳腺細胞作為靶細胞。首先通過四氮唑藍細胞活力測定法(MTT)對經(jīng)淫羊藿素處理的SK-Br-3乳腺癌細胞、LnCap前列腺癌細胞以及MCF-10a正常乳腺細胞進行細胞生長抑制檢測。以濃度梯度淫羊藿素處理細胞72hr，未處理細胞作為參照，明確淫羊藿素

7、能否有效抑制SK-Br-3細胞和LnCap細胞生長，以及對正常細胞是否具有細胞毒性作用。同時通過流式細胞儀檢測淫羊藿素是否促進SK-Br-3細胞凋亡，即sub-G1期細胞數(shù)量是否增加。在48hr時觀察不同濃度作用下SK-Br-3細胞的細胞形態(tài)，進一步評價淫羊藿素的細胞毒性作用。 二、淫羊藿素誘導腫瘤細胞凋亡和生長抑制的分子機制研究 本部分實驗的主要目的是明確淫羊藿素腫瘤細胞毒性的作用靶點及其影響的信號通路。在以往的研究中

8、，F(xiàn)AS被認為是黃酮類化合物抗腫瘤活性的一個靶點，然而將這一靶點與FAS/HER2信號通路聯(lián)系起來的研究還未見報道。本實驗首先檢驗外源軟脂酸對淫羊藿素的細胞毒性是否具有逆轉(zhuǎn)作用。軟脂酸作為FAS的直接產(chǎn)物，當酶活性受到抑制時，其產(chǎn)量下降，進而影響細胞增殖。如在培養(yǎng)基中加入一定量的軟脂酸，理論上可以完全彌補這一缺失。在淫羊藿素給藥前，將SK-Br-3細胞與軟脂酸共同孵育，隨后加入淫羊藿素，觀察軟脂酸對淫羊藿素細胞毒性作用的影響。在隨后的淫

9、羊藿素抑制FAS活性的試驗中，將提取于SK-Br-3細胞的蛋白提取液與半數(shù)抑制濃度的淫羊藿素孵育10min，與反應液混合后，在紫外分光光度計下檢測340nm處NADPH的吸光度變化。這是一種基于NADPH消耗的酶活性測定方法，簡單易行。當FAS活性被抑制時，NADPH的利用度就會下降，測得的340nm處吸光度值高；反之則低。該實驗能夠反映淫羊藿素對FAS活性的抑制程度。 為了明確淫羊藿素對FAS/HER2細胞信號通路的作用，在淫

10、羊藿素給藥后，應用Western blot檢測SK-Br-3細胞表達HER2、多瘤增強子活化子3(polyoma enhanceractivator3，PEA3)蛋白的變化。PEA3是處于FAS與HER2通路之間的一個分子。當FAS受到抑制時，PEA3表達增加，與HER2基因啟動子結(jié)合，進而抑制HER2表達。因此，如果淫羊藿素能夠抑制FAS活性，則PEA3表達升高，而HER2表達降低。 實驗結(jié)果： 一、淫羊藿素誘導腫瘤細

11、胞凋亡和生長抑制 MTT試驗結(jié)果顯示，淫羊藿素對SK-Br-3細胞和LnCap細胞的半數(shù)抑制濃度分別為8.6μg/mL和3.08μg/mL，而對正常乳腺細胞MCF-10a的半數(shù)抑制濃度大于20μg/mL。在藥物濃度為5μg/mL時，SKBr3細胞及LnCap細胞存活率與未加藥組之間即有顯著差異(P＜0.001)，而MCF-10a與未加藥組之間在20μg/mL才有顯著差異(P＜0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著淫羊藿素給藥

12、時間延長，SK-Br-3細胞株的凋亡率逐漸提高。48hr DMSO空白對照組凋亡率為0.57±0.11％，淫羊藿素給藥36hr組凋亡率為8.12±1.13％，48hr組為49.55±1.01％，且各組之間具有顯著差別(P＜0.01)。細胞形態(tài)學觀察結(jié)果也顯示，隨著給藥濃度增加，細胞間連接減少，細胞數(shù)量降低，細胞形態(tài)變圓，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。 以上結(jié)果表明，淫羊藿素可有效誘導SK-Br-3細胞和LnCap細胞凋亡和生長抑制，并呈濃度依賴

13、性，而正常細胞對淫羊藿素不敏感，提示淫羊藿素可以作為抗腫瘤藥物進行進一步的實驗。 二、淫羊藿素通過抑制FAS活性抑制腫瘤細胞生長 外源軟脂酸逆轉(zhuǎn)實驗結(jié)果顯示，在淫羊藿素分別為8μg/mL、5μg/mL，和2.5μg/mL時，7μg/mL軟脂酸可使腫瘤細胞存活率分別提高18.30±1.0％、21.87±0.9％和15.37±2.5％，均具有顯著差異(P＜0.05)。說明軟脂酸對淫羊藿素的細胞毒性具有一定的逆轉(zhuǎn)作用，提示FA

14、S可能是淫羊藿素的一個作用靶點。進一步實驗結(jié)果顯示，與對照組(DMSO)相比，淫羊藿素半數(shù)抑制濃度給藥后FAS活性明顯下降。在5μg/mL、8.6μg/mL和20μg/mL給藥濃度時，與未給藥組相比，F(xiàn)AS抑制率分別為15.35％、49.26％和70.11％。因此我們認為，淫羊藿素的腫瘤細胞毒性作用是通過其對FAS活性抑制實現(xiàn)的，即FAS是淫羊藿素的一個作用靶點。 三、淫羊藿素通過影響FAS-HER2通路抑制腫瘤細胞生長

15、 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，淫羊藿素給藥組SK-Br-3細胞HER2表達下降，為未給藥組的0.63倍，而PEA3表達增高，為未給藥組的6.58倍，與淫羊藿素抑制腫瘤細胞生長的作用一致。提示對FAS/HER2表達通路的影響是淫羊藿素的腫瘤細胞毒性作用的另一分子機制。 研究結(jié)論： 1.淫羊藿素能夠誘導雌激素受體陰性腫瘤細胞凋亡和生長抑制； 2.淫羊藿素的作用靶點為FAS，通過抑制FAS活性