果蠅SMC5-6復(fù)合物成員NSE4與p53相互作用研究.pdf

1、p53抑癌蛋白在DNA的損傷應(yīng)答和修復(fù)機(jī)制中起極為重要的作用，在超過(guò)50％的人類(lèi)惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變而且90％集中于中部的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域處，因此p53作用的主要分子機(jī)制是作為轉(zhuǎn)錄因子激活其靶基因表達(dá)。SMC5/6作為新發(fā)現(xiàn)的SMC（Structural maintenance of chromosomes）復(fù)合物家族成員，與Cohesin和Condensin的功能有所不同，主要參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程，但其作用機(jī)制仍不明了

2、。 在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究中，曾對(duì)果蠅基因組一個(gè)未知基因CG13142的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其與果蠅p53具有物理水平、轉(zhuǎn)錄水平和遺傳學(xué)水平上的相互作用。但該基因的屬性仍不清楚。本論文對(duì)該基因進(jìn)行了進(jìn)一步分子水平的鑒定，并對(duì)其基因功能進(jìn)行了初步研究。 1． CG13142是酵母，哺乳動(dòng)物nse4的同源基因。 對(duì)CG13142基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)序列的BLAST同源序列搜索和物種間比對(duì)結(jié)果表明其與哺乳動(dòng)物及酵母中的NS

3、E4蛋白具有最高相似性，其C端序列更趨保守，符合NSE4蛋白的序列特征。提示CG13142可能編碼果蠅NSFA。由于在酵母和哺乳動(dòng)物中，NSEA作為SMC5/6蛋白復(fù)合物的必要組分均為與SMC5和SMC6蛋白有直接作用，因此，我們用體外重組蛋白驗(yàn)證了CG13142編碼蛋白與果蠅SMC5的直接物理結(jié)合作用。這些結(jié)果表明，CG13142確實(shí)編碼NSE4的同源蛋白。我們將CG13142命名為dnse4。 2． NSE4和p53的相互作

4、用在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中得到加強(qiáng) 我們進(jìn)一步觀察了哺乳動(dòng)物NSE4與p53蛋白的相互作用。結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，NSE4的兩種亞型NSE4a和NSE4b和p53的相互作用比較微弱，但細(xì)胞經(jīng)UV照射引起DNA損傷時(shí)，這種相互作用明顯增強(qiáng)。因此，NSEA與p53蛋白的這種相互作用可能在DNA損傷應(yīng)答中起作用。該結(jié)果也表明，我們?cè)诠壷邪l(fā)現(xiàn)的NSFA和p53的相互作用在物種間是保守的。 3．dNSE4抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄

5、作用 為了進(jìn)一步研究NSE4與p53相互作用的生物學(xué)功能，我們對(duì)dnse4參與p53轉(zhuǎn)錄過(guò)程的可能性進(jìn)行了探索。在p53的功能調(diào)控中，CREB binding protein/p300（CBP）發(fā)揮著重要的作用，一方面CBP乙酰化p53使之成為活性蛋白，另一方面CBP也可以作為共激活因子直接參與p53的轉(zhuǎn)錄激活作用。我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，dNSFA和果蠅CBP的C末端存在直接的相互作用。在細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)dnse4可以抑制dCB

6、P依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄激活作用；而利用RNA干涉降低dNSE4的表達(dá)則可促進(jìn)dCBP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用，表明果蠅細(xì)胞內(nèi)源性dNSE4也具有相同的這種作用。我們進(jìn)一步在體考察了dnse4基因?qū)塸53的靶基因之一hid表達(dá)的影響。我們的初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)dnse4 RNA干涉果蠅中hid基因表達(dá)量有所上升?？紤]到我們以前發(fā)現(xiàn)的dNSE4和p53之間的相互作用，這些結(jié)果提示，NSE4可能直接參與p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，起負(fù)向調(diào)控作用。因?yàn)閔id果蠅p53凋