系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞表型的Logistic回歸分析及Smad7基因啟動子甲基化狀態(tài)的相關研究.pdf

1、第一章系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細胞系的建立、鑒定及生長特性研究 目的：建立原代培養(yǎng)系統(tǒng)性硬皮病患者皮膚成纖維細胞的穩(wěn)定方法，對體外培養(yǎng)的成纖維細胞進行鑒定，并初步研究成纖維細胞的體外培養(yǎng)的生長特性，為后階段實驗建立堅實基礎。 方法：采用組織塊法原代培養(yǎng)皮膚成纖維細胞；倒置光學顯微鏡觀察成纖維細胞生長形態(tài)，同時結(jié)合免疫細胞化學方法對細胞進行鑒定；采用MTT法測定體外培養(yǎng)的成纖維細胞生長曲線。 結(jié)果：皮膚成纖維細胞

2、約1周左右從組織塊周圍爬出，約3周左右時間可成功傳代；培養(yǎng)細胞呈梭形，細胞排列極性明顯，呈放射狀或漩渦狀，免疫細胞化學顯示波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，培養(yǎng)細胞鑒定為成纖維細胞；MTT法測皮膚成纖維細胞生長曲線顯示，細胞生長曲線呈現(xiàn)“S”型，細胞生長狀態(tài)良好，適合下一步實驗。 結(jié)論：體外成功培養(yǎng)系統(tǒng)性硬皮病皮膚成纖維細胞，符合成纖維細胞鑒定標準，成纖維細胞生長狀態(tài)良好，為我們進行下階段實驗保證了充足實驗材料。 第二章

3、系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細胞表型的Logistic回歸分析 背景與目的：系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細胞在體外培養(yǎng)時可展現(xiàn)出膠原蛋白分泌過高的硬皮病表型，具有硬皮病表型的成纖維細胞也成為系統(tǒng)性硬皮病研究的最重要材料之一。但是，并不是所有來自患者皮損的成纖維細胞均表現(xiàn)出硬皮病表型，而目前極少前瞻性的資料可協(xié)助研究者預估皮損成纖維細胞硬皮病表型的發(fā)生概率。因此，我們開展前瞻性研究對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞表型進行Logistic回歸分

4、析，尋找相關的預測因子，建立預測模型。 方法：招募15名系統(tǒng)性硬皮病患者，記錄其臨床與實驗室資料，進行Rodnan皮損評分(TSS)、病情活動度評分(VDAI)、病情嚴重度評分(MDSS)等評估，進行組織HE染色病理檢查，同時通過原代培養(yǎng)建立皮損成纖維細胞系。采用實時定量RT—PCR檢測成纖維細胞前膠原蛋白1α2轉(zhuǎn)錄水平。最后，使用Logistic回歸分析各細胞系資料。 結(jié)果：8例系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞系表現(xiàn)出膠原分泌過

5、高的硬皮病表型。Logistic回歸分析得出模型Y＝—9.718+2.525X7，X7代表病情活動度評分(VDAI)。組織病理結(jié)果顯示，系統(tǒng)性硬皮病表型與血管周圍白細胞浸潤呈正相關關系。 結(jié)論：建立了系統(tǒng)性硬皮病患者皮損成纖維細胞表型預測模型Y=—9.718+2.525X7。本實驗顯示系統(tǒng)性硬皮病皮損成纖維細胞表型與病情活動度呈正相關關系。當研究者欲獲得具有硬皮病表型的成纖維細胞系時，可利用該模型進行評估，以預先估計高膠原分泌成

6、纖維細胞系的發(fā)生概率。 第三章系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞甲基化相關因子的表達和5-氮雜—2-脫氧胞苷對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞膠原蛋白及相關因子表達的影響 背景與目的：近年來，表觀遺傳學中的DNA甲基化等成為許多生命科學研究的前沿與熱點，在硬皮病等多基因疾病的相關研究中顯示出巨大潛力。本實驗擬檢測系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞甲基化相關因子的表達情況，探討5-氮雜—2-脫氧胞苷對系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞膠原蛋白及相關因子表達的影響。

7、 方法：采用實時定量RT—PCR技術，分別測定系統(tǒng)性硬皮病組和對照組皮膚成纖維細胞系甲基化相關因子Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、MBD1、MBD2、MeCP2、Kaiso等的mRNA表達水平；然后，使用甲基轉(zhuǎn)移酶5-氮雜—2-脫氧胞苷對體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞進行72小時干預；最后，檢測系統(tǒng)性硬皮病組成纖維細胞在5-氮雜—2-脫氧胞苷干預前后Collα2、TGF—β1、Smad7等基因mRNA表達水平。 結(jié)果：與健

8、康對照組比較，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞Dnmt1、Collα2、TGF—β1基因mRNA表達增高，Smad7基因mRNA表達減少(P<0.05)。5-氮雜—2-脫氧胞苷處理后，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞Collα2、TGF—β1基因轉(zhuǎn)錄水平回落，而Smad7基因表達也上升至正常范圍。 結(jié)論：系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞存在甲基轉(zhuǎn)移酶表達異常，Dnmt1等表觀遺傳機制可能參與了系統(tǒng)性硬皮病發(fā)病過程，Dnmt1抑制劑5-氮雜—2-脫氧胞苷可能成

9、為系統(tǒng)性硬皮病治療的新選擇。 第四章系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞Smad7基因啟動子甲基化狀態(tài)的相關性研究 背景與目的：前階段研究顯示，系統(tǒng)性硬皮病成纖維細胞甲基轉(zhuǎn)移酶1表達增高；當使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜—2-脫氧胞苷對硬皮病成纖維細胞進行干預時，原本低表達的Smad7基因出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄增加，同時膠原蛋白與TGF表達回落。研究提示系統(tǒng)性硬皮病Smad7基因低表達的致病機制可能有甲基化過程參與。因此，本階段實驗擬檢測系統(tǒng)性硬皮病

10、組與正常對照組Smad7基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，分析其與疾病發(fā)生的可能關系。 方法：首先，應用MethPrimer軟件分析Smad7基因啟動子區(qū)域CpG位點分布情況，對CpG島進行預測，同時設計引物。接著，采用巢式PCR和降落PCR技術，對重亞硫酸鹽修飾法處理的DNA進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后克隆測序，使用QUMA軟件分析結(jié)果。最后，甲基化特異性PCR(MSP)對多細胞系相應CpG位點進行檢測，實時定量RT—PCR檢測

11、各細胞系Smad7轉(zhuǎn)錄情況，分析可能關系。 結(jié)果：在Smad7啟動子-1～-1000bp區(qū)域預測到兩個甲基化島；重亞硫酸鹽測序PCR(BSP)檢測顯示系統(tǒng)性硬皮病組與健康對照組相應啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)存在統(tǒng)計學差異，其中第—851，—819位CpG位點的甲基化狀態(tài)差異顯著，P<0.05；甲基化特異性PCR(MSP)顯示Smad7基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與Smad7基因的轉(zhuǎn)錄水平存在負相關關系。 結(jié)論：系統(tǒng)性硬皮病成纖維