抑制自噬增加阿霉素對骨髓瘤細(xì)胞的促凋亡活性.pdf

1、研究背景和目的：
　　自噬作為廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，是細(xì)胞成分更新、發(fā)育、分化的重要調(diào)控機制，對維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。自噬是目前細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點之一，自噬與腫瘤關(guān)系的研究更被廣泛關(guān)注。1999年Beth Levine等發(fā)現(xiàn)Beclin1單等位基因缺失致乳腺癌等患病率升高，人們認(rèn)為自噬與腫瘤發(fā)生相關(guān)，并探尋誘導(dǎo)自噬治療腫瘤。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬具有兩面性，某些情況下，誘導(dǎo)自噬可以抑制腫瘤生長，

2、并致自噬相關(guān)性細(xì)胞死亡；但更多情況下，腫瘤細(xì)胞可利用自噬以應(yīng)對缺氧、營養(yǎng)匱乏及清除氧自由基、損傷的線粒體等，從而保護(hù)瘤細(xì)胞。值得注意的是：自噬對腫瘤的影響具有細(xì)胞類型及剌激依賴性，在不同的腫瘤類型與剌激條件下，自噬所起作用可能不同。多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞因分泌大量免疫球蛋白，蛋白質(zhì)代謝極為旺盛，而自噬作為蛋白質(zhì)降解代謝主要途徑之一，對MM細(xì)胞死亡過程中究竟起著什么樣的作用，目前尚無前人的經(jīng)驗可循。本課題以MM細(xì)胞系RPMI8226、H

3、929及原代細(xì)胞為研究材料，探尋自噬對阿霉素（DOX）等化療藥物的促MM細(xì)胞凋亡的活性及其相關(guān)機制。
　　方法和結(jié)果：
　　1.MTT法首先探尋自噬抑制劑羥氯喹（HCQ）或自噬激活劑雷帕霉素（RAPA）單藥對RPMI8226及H929細(xì)胞的影響，以明確其劑量-效應(yīng)關(guān)系；結(jié)果表明羥氯喹能夠抑制兩種細(xì)胞的增殖，并呈濃度依賴性，而雷帕霉素對細(xì)胞增殖基本無影響。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，亞細(xì)胞毒劑量的自噬抑制劑羥氯喹、3-me

4、thlyadenine（3-MA）、Bafilomycin A1（BAF），與阿霉素、順鉑（DDP）、米托蒽醌（MIT）、馬法蘭（MEL）等合用均可產(chǎn)生增敏作用，與單藥相比差異顯著（P＜0.05)；而與長春新堿（VCR）、Bortezomib（BOR）、足葉乙甙（VP-16）等聯(lián)用則無效（P＞0.05）。
　　3.透射電鏡證實：3MA單藥處理組及未處理組自噬泡少見，羥氯喹+阿霉素、BAF+阿霉素組及雷帕霉素陽性對照組可見到大量自噬

5、泡，羥氯喹、BAF及阿霉素單用組可見中等量自噬泡出現(xiàn)，3-MA+阿霉素聯(lián)用組僅見少量自噬泡。
　　4.內(nèi)源性LC3免疫熒光染色顯示，羥氯喹+阿霉素、BAF+阿霉素及雷帕霉素處理組MM細(xì)胞胞漿可見大量顆粒狀熒光，羥氯喹、BAF、阿霉素單用組僅有中等量顆粒狀熒光，而3-MA及3-MA+阿霉素組胞漿熒光信號基本呈彌散分布，類似于未處理對照組。
　　5.Western blot證實：
　　①阿霉素單藥處理RPMI8226及H9

6、29細(xì)胞后8、12、24、36h，自噬蛋白Beclin1、Atg5、LC3-II表達(dá)漸升高，說明阿霉素誘導(dǎo)自噬活化。
　　②Beclin1、Atg5、LC3-II表達(dá)分析表明，自噬抑制劑3-MA、羥氯喹及BAF的化學(xué)增敏作用分別與其對MM細(xì)胞自噬反應(yīng)的早期抑制（阻斷自噬體膜形成）與晚期抑制（抑制自噬體與溶酶體融合）有關(guān)。
　?、鄣蛲龅鞍譪aspase-3及PARP檢測表明，自噬抑制劑與阿霉素聯(lián)用凋亡蛋白表達(dá)高于單用阿霉素組。

7、
　　6.siRNA技術(shù)證明：特異性Beclin1及Atg5 siRNA導(dǎo)入RPMI8226及H929細(xì)胞致Beclin1及Atg5沉默，亦可增加阿霉素誘導(dǎo)的MM凋亡。
　　7.小鼠模型證明：體內(nèi)環(huán)境下，抑制自噬亦可增加阿霉素抑MM效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1.阿霉素能夠誘導(dǎo)MM凋亡同時誘發(fā)自噬反應(yīng)，自噬是瘤細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷應(yīng)激的一種保護(hù)性反應(yīng)；
　　2.化學(xué)抑制劑及siRNA抑制自噬，均可增加阿霉素誘導(dǎo)的