納米氧化鋅與氯化鎘聯(lián)合作用對人肝癌HepG2細胞的毒性行為研究——結(jié)合代謝組學(xué)與細胞毒性分析方法.pdf

1、背景：隨著納米氧化鋅（ZnO NPs）的規(guī)?；a(chǎn)和普及，其在人群或環(huán)境中的暴露機會將大大增加，對其生物安全性的研究也刻不容緩。大量致力于ZnO NPs在分子、細胞、組織以及動物水平的毒理學(xué)研究，均是基于ZnO NPs與生物體的直接相互作用。ZnO NPs由于其特殊的表面效應(yīng)，極易與環(huán)境中的各種有毒金屬離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的金屬-ZnO NPs復(fù)合物，也將不可避免的發(fā)生復(fù)雜的聯(lián)合毒性效應(yīng)。而目前有關(guān)與環(huán)境污染物共存的ZnO NPs對周圍環(huán)

2、境生物的間接毒性效應(yīng)以及對其產(chǎn)生的細胞內(nèi)代謝物的動態(tài)變化影響，至今尚無相關(guān)研究。
　　目的：(1).探討納米氧化鋅(ZnO NPs)與氯化鎘(CdCl2)之間理化性質(zhì)的相互作用；
　　(2).探討ZnO NPs與CdCl2聯(lián)合誘導(dǎo)HepG2細胞的毒性效應(yīng)；
　　(3).探討基于GC-MS的代謝組學(xué)研究用于ZnO NPs與CdCl2聯(lián)合誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的毒性機制。
　　方法：采用動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)和掃描

3、電子顯微鏡技術(shù)(SEM)觀察CdCl2對ZnO NPs的粒徑及表面性狀的影響；采用火焰原子吸收分光光度儀(AAS)研究ZnO NPs對CdCl2的表面吸附作用；采用透射電子顯微技術(shù)(TEM)來觀察HepG2細胞對ZnO NPs的細胞內(nèi)吞作用及可能產(chǎn)生的病理形態(tài)；采用CCK-8比色法、中性紅(NRU)攝入法及LDH釋放法來研究ZnO NPs與CdCl2聯(lián)合誘導(dǎo)對HepG2細胞的細胞活性影響；運用流式細胞檢測儀，DCFH-DA（2’-,7’

4、-dichlorodihydrofluorescein-diacetate）作為熒光探針，對ZnO NPs與CdCl2單獨及聯(lián)合作用下HepG2細胞內(nèi)ROS含量進行檢測；運用堿性彗星實驗（alkaline comet assay）檢測ZnO NPs與CdCl2單獨及聯(lián)合作用引起的DNA斷裂損傷；運用流式細胞檢測儀檢測ZnO NPs與CdCl2單獨及聯(lián)合作用對HepG2細胞早期凋亡與晚期凋亡的影響；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）

5、來檢測ZnO NPs與CdCl2單獨及聯(lián)合作用所引起的細胞內(nèi)源性代謝物的動態(tài)變化。
　　結(jié)果：DLS、SEM與火焰原子吸收的結(jié)果顯示，與單一的ZnO NPs比較，添加CdCl2能夠誘導(dǎo)ZnO NPs發(fā)生聚集，改變顆粒表面性質(zhì)，從而影響ZnO NPs在水溶液中的粒徑分布，并且隨著ZnO NPs濃度的增加，其對Cd2+的物理吸附能力變大。TEM結(jié)果顯示，HepG2細胞經(jīng)ZnO NPs處理后會出現(xiàn)細胞膜破損，細胞核分解、染色體凝聚等凋亡

6、現(xiàn)象；CCK-8實驗、NRU實驗與LDH實驗結(jié)果表明ZnO NPs與CdCl2對HepG2細胞活性均有抑制作用，且兩者的聯(lián)合作用表現(xiàn)出協(xié)同毒性效應(yīng)；析因分析結(jié)果顯示ZnO NPs與CdCl2對HepG2細胞的氧化應(yīng)激，DNA損傷及細胞凋亡等毒性作用均表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，而ZnO NPs的混合染毒液對HepG2也顯示出一定協(xié)同毒性作用。細胞代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ZnO NPs與CdCl2的聯(lián)合誘導(dǎo)可引起細胞內(nèi)代謝物發(fā)生顯著性變化，并嚴(yán)重干

7、擾細胞內(nèi)檸檬酸循環(huán)途徑（TCA），糖酵解途徑，磷酸戊糖途徑(PPP),脂肪酸生物合成途徑，氨基酸及核酸代謝途徑等。
　　結(jié)論：ZnO NPs對CdCl2有明顯的吸附作用，從而影響顆粒的表面性質(zhì)；ZnO NPs可與細胞表面發(fā)生相互作用，并在體內(nèi)蓄積，誘導(dǎo)凋亡連鎖反應(yīng)；ZnO NPs與CdCl2的單獨與聯(lián)合作用均可誘導(dǎo)HepG2細胞活性抑制、氧化應(yīng)激、DNA損傷及細胞凋亡，析因設(shè)計結(jié)果表明兩者的毒性作用存在協(xié)同作用；首次采用基于GC-