曲格列酮對(duì)HepG2及其CD133肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性差異研究.pdf

1、目的：分離與鑒定肝癌細(xì)胞HepG2中CD133標(biāo)記的肝癌干細(xì)胞；初步探討曲格列酮（Tro）對(duì)HepG2及其肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性差異。
　　方法：利用流式細(xì)胞分選儀分選純化HepG2中的CD133陽(yáng)性和陰性細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分選后細(xì)胞亞群；通過(guò)利用流式細(xì)胞儀和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分選前后CD133表達(dá)和干性相關(guān)蛋白Oct4和c-Myc的表達(dá)；采用懸浮微球形成法，平板克隆形成法和Transwell侵襲和遷移，BALB/

2、c裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)及其腫瘤組織的免疫組化和HE染色，細(xì)胞周期的檢測(cè)增殖能力和MTT法測(cè)定肝癌干細(xì)胞的耐藥性來(lái)共同鑒定肝癌干細(xì)胞；通過(guò)CCK8法對(duì)比Tro與鹽霉素對(duì)CD133肝癌干細(xì)胞毒性情況；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定Tro對(duì)細(xì)胞上清AST、ALT、LDH、ALB、BUN、TP生化指標(biāo)的變化，熒光法檢測(cè)Tro對(duì)CYP酶總活性和ROS水平的影響，Western blot法分析藥物處理后CYP1A2的變化；流式細(xì)胞儀分析Tro處理后的細(xì)胞周期和細(xì)

3、胞凋亡變化來(lái)研究Tro顯示的細(xì)胞毒性差異。
　　結(jié)果： CD133型腫瘤干細(xì)胞在HepG2中占（0.72±0.05）％，CD133+細(xì)胞分選后純度為98.7%；CD133+細(xì)胞中CD133、c-Myc和Oct4表達(dá)不同程度高于親本細(xì)胞；CD133+細(xì)胞微球形成力，克隆形成力以及Transwell遷移與侵襲能力等明顯高于親本細(xì)胞，且CD133+細(xì)胞腫瘤形成能力顯著升高。同時(shí)，CD133+細(xì)胞群大多處于G0/G1期，G2/M期未得到阻

4、滯，并且對(duì)索菲替尼表現(xiàn)較大耐藥性；Tro處理12 h，24 h，48 h，72 h后，肝癌干細(xì)胞IC50為（150.52±1.25）μmol/L，（99.08±1.90）μmol/L，（43.96±0.71）μmol/L和（14.81±1.30）μmol/L，顯著低于HepG2，具有明顯量效-關(guān)系，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Tro處理48 h時(shí)，肝癌干細(xì)胞上清 AST、TP、LDH、ALB、BUN生化指標(biāo)不同程度升高，其中LDH升高水平較親本細(xì)

5、胞高；CYP450總活性和ROS水平出現(xiàn)明顯抑制，CYP1A2抑制程度隨濃度增加。在細(xì)胞凋亡中Tro能夠引起CD133+細(xì)胞發(fā)生早期凋亡和壞死，顯著高于親本細(xì)胞，顯示較大Tro的細(xì)胞毒性差異；在對(duì)細(xì)胞周期影響中，Tro能較少GO/G1期細(xì)胞比重，增加S期和G1/M期，顯示較大Tro的細(xì)胞選擇毒性差異。
　　結(jié)論：成功篩選和鑒定具有高增殖能力的CD133+HepG2腫瘤干細(xì)胞，在Tro引起肝細(xì)胞毒性方面較HepG2細(xì)胞更為敏感性，顯