納米四氧化三鐵和鎘聯(lián)合作用對人肝癌HepG2細(xì)胞DNA損傷的影響.pdf

1、納米顆粒在理化性質(zhì)發(fā)生巨變的同時，其生物學(xué)效應(yīng)的性質(zhì)和強度也可能發(fā)生質(zhì)的變化，隨著納米科技的發(fā)展和納米材料的廣泛應(yīng)用，人類接觸納米材料的機會也迅速增多，因此納米材料的生物安全性問題正逐漸受到人們的關(guān)注。納米材料具有大量的界面，具有很強的吸附能力，從而能對金屬離子或有機物產(chǎn)生吸附作用。當(dāng)納米材料大量進入環(huán)境后，特殊的表面效應(yīng)使得其極易與環(huán)境中的多種污染物結(jié)合。重金屬鎘是一種廣泛存在的環(huán)境污染物。鎘可引起DNA損傷，具有致癌、致畸、致突變作

2、用，是已確定的人類致癌物。作為環(huán)境中的常見致癌物，重金屬鎘與納米材料的相互作用，對機體可能導(dǎo)致的各種健康效應(yīng)有何變化，至今尚無研究。系統(tǒng)了解納米材料與環(huán)境常見污染物的聯(lián)合作用所致健康效應(yīng)，不僅可以深入了解納米材料在環(huán)境中的變化規(guī)律，也為深入了解納米材料的健康效應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。 本研究主要通過一系列的體外實驗來探究納米四氧化三鐵與鎘聯(lián)合作用對人肝癌HepG2細(xì)胞株的生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因(GrowtharrestandDNA

3、damage-induciblegene，GADD)153表達的影響和DNA斷裂損傷、染色體損傷及凋亡等情況的影響，系統(tǒng)研究納米四氧化三鐵與鎘聯(lián)合作用所致DNA損傷效應(yīng)，為進一步深入了解環(huán)境中納米金屬氧化物的健康效應(yīng)提供實驗依據(jù)。 第一部分 本部分主要研究了不同濃度的納米四氧化三鐵(nano-Fe3O4)和氯化鎘(CdCl2)聯(lián)合作用在體外對人肝癌HepG2細(xì)胞株生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因GADD153啟動子誘導(dǎo)和GA

4、DD153基因表達水平的影響。本研究利用含pGADD153啟動子的重組人肝癌HepG2細(xì)胞檢測GADD153啟動子活性，用RT-PCR測定內(nèi)源性GADD153基因mRNA水平。重組人肝癌HepG2細(xì)胞的主要過程如下：將GADD153啟動子插入pGL3basic螢光素酶表達質(zhì)粒的螢光素酶基因上游，得到含GADD153啟動子的pGADD153-LUC質(zhì)粒，再用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞，構(gòu)建pGADD153-LUC質(zhì)粒重組HepG2細(xì)胞

5、檢測體系。外來化合物引起DNA損傷時，將誘導(dǎo)重組HepG2細(xì)胞GADD153啟動子的活性增加，啟動子活性增加導(dǎo)致螢光素酶表達增加，因此螢光素酶的表達量可以反映該啟動子序列的活性程度，從而間接反應(yīng)外來化合物的DNA損傷效應(yīng)。我們設(shè)計了4組濃度的nano-Fe3O4(0g/L、0.002g/L、0.01g/L、0.05g/L)×4組濃度的CdCl2(0μmol/L、0.2μmol/L、1μmol/L、5μmol/L)共16組受試物進行實驗。

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨的nano-Fe3O4能增加螢光素酶的表達但無顯著差異，CdCl2單獨作用能引起螢光素酶的表達的顯著增加(P＜0.01)，nano-Fe3O4和CdCl2聯(lián)合作用能夠增加螢光素酶的表達且有協(xié)同作用(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)nano-Fe3O4在1μmol/l和5μmol/l的CdCl2存在的條件下，能誘導(dǎo)GADD153基因表達水平增高。結(jié)果提示：nano-Fe3O4能夠和CdCl2協(xié)同作用增強GADD153啟動子

7、的表達，并增強CdCl2引起的GADD153基因表達。 第二部分 本部分主要研究了不同濃度的納米四氧化三鐵(nano-Fe3O4)和氯化鎘(CdCl2)聯(lián)合作用在體外對人肝癌HepG2細(xì)胞株DNA損傷、染色體損傷和凋亡的影響。以單細(xì)胞凝膠電泳(SingleCellGelElectrophoresis，SCGE)、細(xì)胞松弛素B阻斷核質(zhì)分裂微核法(cytokinesis-blockmicronucleus)和碘化丙啶(pro

8、pidiumiodide，PI)單染流式細(xì)胞術(shù)來分別檢測其對細(xì)胞DNA斷裂損傷、染色體損傷和細(xì)胞凋亡的影響。我們設(shè)計了3組濃度的nano-Fe3O4(0g/L、0.01g/L、0.05g/L)×3組濃度的CdCl2(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L)共9組受試物進行實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CdCl2能引起DNA斷裂損傷、微核率的增加和細(xì)胞凋亡率的增加；nano-Fe3O4能引起DNA斷裂損傷增加，但無顯著意義，未引起微核率和細(xì)胞凋亡