低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量緩激肽增加血腫瘤屏障通透性機(jī)制的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的45％，傳統(tǒng)多采用手術(shù)治療。由于腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，大多與正常腦細(xì)胞組織無明顯分界，一些部位深的腫瘤常侵犯腦重要功能區(qū)，手術(shù)難以切除根治，化療是其主要的治療方法之一。在腦膠質(zhì)瘤中，即使腫瘤組織可以局部、不均一地破壞血腦屏障(BBB)，但是血腫瘤屏障(BTB)的存在仍然限制藥物進(jìn)入腫瘤組織。常規(guī)化療的失敗不是因?yàn)樗幬锉旧?，而是沒有足夠的藥物進(jìn)入腫瘤組織。尤其是近年來，隨著分子生

2、物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多肽類，蛋白質(zhì)，多核苷酸等物質(zhì)作為潛在的抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)，由于其分子量大無法穿透BTB，限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。藥物通過BTB一般有兩種途徑：細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑。根據(jù)藥物理化性質(zhì)，親水性藥物以細(xì)胞旁途徑，親脂性藥物以跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)通過BTB，并且跨細(xì)胞途徑能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與白蛋白大小相似或比其大的血漿蛋白。在正常BBB和BTB，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)具有很低的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)功能，限制了許多大分子和顆粒性藥物進(jìn)入腦組織和

3、腫瘤組織。如何增加BMECs跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是增加化療藥物進(jìn)入腫瘤組織、提高化療療效的關(guān)鍵。為了有效的轉(zhuǎn)運(yùn)藥物進(jìn)入腫瘤組織而不影響正常腦組織，需要尋找能夠選擇性開放BTB的策略，這既可以使治療藥物靶向進(jìn)入腫瘤組織，提高藥物療效，又減少藥物對正常腦組織的毒副作用。 應(yīng)用低頻超聲輻照在一定聲強(qiáng)控制下可非侵襲性、可逆性、選擇性開放BBB，而不損害輻照部位的腦組織。低頻超聲輻照能通過增加BMECs吞飲小泡的數(shù)量增強(qiáng)BBB的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但是具

4、體的分子機(jī)制不清。 小劑量緩激肽(BK)頸內(nèi)動(dòng)脈灌注可以選擇性開放BTB，而不影響正常腦組織。BK主要是通過位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的B2受體起作用：BK與B2受體結(jié)合后，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，增高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+能激活一氧化氮合成酶(NOS)產(chǎn)生一氧化氮(NO)。NO進(jìn)而激活可溶性鳥苷酸還化酶(sGC)，產(chǎn)生高濃度cGMP，引起吞飲小泡增加，使BTB通透性增加。 質(zhì)膜微囊(Caveolae)是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性的內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，

5、是一種參與內(nèi)皮細(xì)胞跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞器，它的主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)或內(nèi)化小分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。Caveolins是caveolae的主要功能結(jié)構(gòu)蛋白。在腦組織中，caveolin—1，2主要表達(dá)在BMECs中，caveolin—3主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。Caveolin—1修飾于caveolae的內(nèi)表面，是caveolae的標(biāo)志性蛋白，在維持caveolae形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能中起重要作用。Caveolin—2與caveolin—1有相同的組

6、織和細(xì)胞分布，caveolin—2對caveolin—1的結(jié)構(gòu)維持，膜定位及調(diào)節(jié)caveolae的動(dòng)力學(xué)方面有重要作用。Caveolin—1與caveolin—2形成穩(wěn)定的異源寡聚體復(fù)合物，共同定位于caveolae的質(zhì)膜區(qū)域內(nèi)，二者共同參與BMECs的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)過程。 本研究首先確定低頻超聲輻照開放BBB，而沒有腦組織損傷的聲學(xué)參數(shù)，然后通過建立大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，應(yīng)用組織學(xué)、分子生物學(xué)等方法，證明低頻超聲輻照通過增加BMECs

7、胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)選擇性開放BTB的分子機(jī)制，并且聯(lián)合應(yīng)用小劑量BK以求最大限度增加BMECs胞吞飲轉(zhuǎn)運(yùn)，為臨床靶向提高BMECs跨細(xì)胞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的治療策略提供理論基礎(chǔ)。 材料與方法： 1、低頻超聲輻照：德力凱公司EMS—900型腦超儀器(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腦功能檢查室)，探頭頻率1.0MHz，探頭直徑2.0cm，功率在一定范圍內(nèi)可調(diào)。造影劑Optison在每一個(gè)輻照前10s經(jīng)右股靜脈注入，注射容量為0.05ml/kg。

8、 2、超聲窗的制作(降低低頻超聲波的衰減，為了研究精確)：Wistar健康雌性大鼠，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重180～200g。術(shù)前10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，頭頂部皮膚用剪刀剪去，固定于立體定位儀上，正中矢狀切開約2cm切口，鈍性剝離骨膜，用牙科鉆以大鼠冠狀縫上中線右旁開3mm為中心各移去一塊顱骨(3×3mm)，將表皮覆蓋在骨窗并縫合上，5天后備用。 3、大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)：含10％胎

9、牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃，濕度100％，5％CO2條件下培養(yǎng)。 4、大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的制備：常規(guī)培養(yǎng)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用不含胎牛的高糖DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，濃度為1×106/10μl。腹腔注射10％的水合氯醛(3.5ml/kg體重)麻醉大鼠，在立體定位儀上用微量進(jìn)樣器注入大鼠右側(cè)腦尾狀核10μl C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，靶點(diǎn)為冠狀縫前1 mm，矢狀縫右側(cè)旁開3mm，深4.5 mm。腫瘤細(xì)胞移植10-14天后備用

10、。 5、應(yīng)用伊文思蘭(Evans blue，EB)和透射電鏡確定低頻超聲輻照開放BBB，沒有輻照部位腦組織損傷的聲學(xué)參數(shù)。 6、應(yīng)用EB檢測低頻超聲輻照后不同時(shí)間點(diǎn)及聯(lián)合小劑量BK后BTB通透性變化。 7、透射電鏡觀察低頻超聲輻照后不同時(shí)間點(diǎn)及聯(lián)合小劑量BK后BTB中BMECs吞飲小泡數(shù)量的改變。 8、應(yīng)用S-P免疫組織化學(xué)法和免疫熒光化學(xué)法檢測低頻超聲輻照后不同時(shí)間點(diǎn)及聯(lián)合小劑量BK后BTB中BMECs

11、質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的分布和表達(dá)變化。 9、應(yīng)用RT-PCR法和Western blot法檢測低頻超聲輻照后不同時(shí)間點(diǎn)及聯(lián)合小劑量BK后腫瘤組織中腦微血管段質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達(dá)變化。 10、建立體外BTB模型，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)法檢測低頻超聲輻照后BTB中BMECs質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的蛋白

12、表達(dá)和分布改變。 結(jié)果： 1、應(yīng)用低頻超聲輻照(頻率1.0MH，功率12mW，輻照時(shí)間20s)能夠選擇性開放BBB，未見輻照部位腦組織的損傷。 2、低頻超聲輻照后BTB的EB滲出量增加，BMECs吞飲小泡數(shù)量增加，輻照后1.5h EB滲出量最大，BMECs吞飲小泡最多，12h后EB滲出量和吞飲小泡數(shù)量恢復(fù)未輻照水平。 3、低頻超聲輻照后BTB中BMECs質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveoli

13、n—2的mRNA和蛋白表達(dá)升高，輻照后1.5h達(dá)峰值，12h后恢復(fù)未輻照水平。 4、體外BTB模型中，低頻超聲輻照后BMECs質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2表達(dá)明顯增加，輻照后1.5h達(dá)峰值，12h恢復(fù)原來水平，caveolin—1和caveolin—2蛋白的分布呈現(xiàn)由細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì)的分布改變過程。 5、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨(dú)應(yīng)用相比能夠最大限度增加BTB的EB滲出，顯著增加BT

14、B中BMECs吞飲小泡的數(shù)量和質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1、低頻超聲輻照(頻率1.0MHz，功率12mW，輻照時(shí)間20s)能夠選擇性開放血腦屏障。 2、低頻超聲輻照能夠增加BTB的EB滲出和BMECs吞飲小泡的數(shù)量通過跨細(xì)胞途徑增加BTB的通透性。 3、低頻超聲輻照能夠增加BTB中BMECs質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveoli

15、n—2的mRNA和蛋白表達(dá)。 4、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨(dú)應(yīng)用相比顯著增加BTB的EB滲出和BMECs吞飲小泡的數(shù)量通過跨細(xì)胞途徑增加BTB的通透性。 5、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨(dú)應(yīng)用相比顯著增加BTB中BMECs質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達(dá)。 6、質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin—1，caveolin—2的表達(dá)水平上調(diào)可能是BMECs增加