低劑量?jī)?nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ?qū)θ四X膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的腫瘤殺傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　越來(lái)越多的報(bào)道指出腫瘤內(nèi)存在一小部分具有自我更新能力、多向分化潛能以及更強(qiáng)體內(nèi)成瘤能力的細(xì)胞，稱為“腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cells，CSCs）”。膠質(zhì)瘤中腫瘤干細(xì)胞的存在也被證實(shí)是導(dǎo)致其對(duì)化療不敏感，對(duì)放療抵抗及膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的根源。因此，靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma Stem Cells，GSCs)的殺傷性治療已經(jīng)逐漸成為抗腦膠質(zhì)瘤治療的核心。
　　內(nèi)皮-單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ(endothelial

2、 monocyte activating polypeptideⅡ，EMAPⅡ)是從甲基膽蒽A誘導(dǎo)形成的纖維肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，具有多種生物學(xué)功能。有報(bào)道指出EMAPⅡ在胰腺癌和肺癌中可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮凋亡和抑制腫瘤血管生成從而能夠產(chǎn)生抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。我們研究組前期還發(fā)現(xiàn)了EMAPⅡ可通過(guò)下調(diào)緊密連接蛋白從而能夠產(chǎn)生開(kāi)放血腫瘤屏障的作用。但EMAPⅡ能否對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的腫瘤殺傷作用國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，因此EMAPⅡ?qū)δ[

3、瘤細(xì)胞的直接殺傷作用仍然是一個(gè)嶄新的研究方向。
　　本研究圍繞EMAPⅡ能否對(duì)GSCs產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用以及是否能夠誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生細(xì)胞周期阻滯來(lái)解析EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生的腫瘤殺傷作用。同時(shí)分析EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生的腫瘤殺傷作用的機(jī)制是否與凋亡或者自噬相關(guān)。進(jìn)一步分析EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs自噬產(chǎn)生及誘導(dǎo)GSCs細(xì)胞周期阻滯的相關(guān)機(jī)制，進(jìn)而闡明EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的分子機(jī)制，證實(shí)EMAPⅡ在抗人腦膠質(zhì)瘤治療中具

4、有良好的應(yīng)用前景。
　　材料和方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)細(xì)胞株
　　U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購(gòu)自American Type Culture Collection(＜30代)。
　　（二）主要試劑
　　EMAPⅡ，3-methyladenine（3-MA），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)（美國(guó)PeproTech公司）;B27，EGF，b-FGF，DMSO（美國(guó)Sigma公司）;DMEM高糖培

5、養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）;DMEM/F12/Glutamax和胎牛血清（美國(guó)Gibico公司）;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）;線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒及CCK-8檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）;染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）;一抗LC3，p62/SQSTM1，Beclin-1，PI3K，p-PI3K，Akt，p-Ak

6、t，F(xiàn)oxO1和Atg2B（美國(guó)Abcam公司）;一抗p-FoxO1（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）;一抗nestin，β-tubulinⅢ，GFAP和CD133（美國(guó)Millipore公司）;熒光二抗和一抗GAPDH（美國(guó)三塔生物技術(shù)有限公司）。
　?。ㄈ?shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　健康雄性裸鼠，4-6周齡，建立移植瘤模型使用，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買(mǎi)提供。
　　（四）主要儀器

7、>　　細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma scientific公司）;超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;倒置顯微鏡（日本TMS公司）;紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（日本島津公司）;BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）;超聲粉碎機(jī)（德國(guó)Dr.Hielscher公司）;臺(tái)式低溫超速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置（美國(guó)Bio-Rad公司）;轉(zhuǎn)印儀（北京市六一儀器廠）;Las3000成

8、像系統(tǒng)（日本FUJIFILM公司);凝膠成像分析軟件（江蘇捷達(dá)科技有限公司）;Real-time PCR儀（美國(guó)ABI7500）;電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（日本SANYO公司）;恒溫震蕩水?。ü枮I市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬︰87MG來(lái)源膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)的分離培養(yǎng)，應(yīng)用免疫熒光對(duì)提取的細(xì)胞球表面進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記

9、物CD133和nestin的檢測(cè);同時(shí)應(yīng)用免疫熒光對(duì)誘導(dǎo)GSCs多向分化后的細(xì)胞進(jìn)行GFAP和β-tubulinⅢ的檢測(cè)，證實(shí)提取的細(xì)胞球細(xì)胞具有多向分化潛能。
　?。ǘ〤CK-8證實(shí)不同濃度EMAPⅡ作用下產(chǎn)生抑制GSCs增殖能力的變化，明確EMAPⅡ的優(yōu)選濃度，并取該濃度應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)中。
　　（三）應(yīng)用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法檢測(cè)EMAPⅡ作用下誘導(dǎo)GSCs凋亡的產(chǎn)生。
　?。ㄋ模?yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位探針JC

10、-1熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化，解析EMAPⅡ?qū)SCs線粒體膜電位的影響，明確EMAPⅡ作用下GSCs細(xì)胞活力的變化。
　?。ㄎ澹?yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EMAPⅡ作用下GSCs細(xì)胞周期的改變。
　?。?yīng)用透射電鏡觀察EMAPⅡ作用下GSCs中自噬小體的產(chǎn)生。
　?。ㄆ撸?yīng)用免疫熒光檢測(cè)EMAPⅡ作用下GSCs中LC3和p62/SQSTM1的表達(dá)和分布變化，進(jìn)一步驗(yàn)證自噬小體的存在。
　?。ò耍?yīng)用western blo

11、t方法檢測(cè)自噬標(biāo)志性分子LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，同時(shí)檢測(cè)其他自噬相關(guān)蛋白p62/SQSTM1、Beclin1及Atg2B的表達(dá)變化。
　?。ň牛?yīng)用Real time PCR和western blot方法檢測(cè)EMAPⅡ作用下GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路的改變。
　?。ㄊ?yīng)用western blot方法驗(yàn)證給予IGF-1或小干擾RNA使FoxO1的表達(dá)下降后對(duì)EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生自噬及細(xì)胞周期阻滯的

12、影響。
　?。ㄊ唬?yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法進(jìn)一步明確EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生自噬的機(jī)制是否與FoxO1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因蛋白Atg2B的表達(dá)相關(guān)。
　　（十二）建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察EMAPⅡ作用下對(duì)GSCs腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，同時(shí)應(yīng)用自噬抑制劑3-MA明確自噬在EMAPⅡ產(chǎn)生GSCs腫瘤殺傷作用中所起的作用，解析EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生的腫

13、瘤殺傷作用依賴于EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生的自噬性死亡。
　?。ㄊ┙y(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果:
　　1、成功地分離并鑒定了U87MG來(lái)源的GSCs。
　　2、EMAPⅡ不同濃度0.05 nM、0.5 nM、5nM對(duì)GSCs產(chǎn)生細(xì)胞增殖的抑制作用差異不明顯，低劑量(0.05 nM) EMAPⅡ即可對(duì)GSCs產(chǎn)生明顯地腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用，因此選擇了低劑量的EMAPⅡ用于后續(xù)的研究中。
　　3、低劑量EMAPⅡ

14、可明顯降低GSCs的細(xì)胞活力，在EMAPⅡ作用0.5h時(shí)效果最為明顯，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活力逐漸恢復(fù)。自噬抑制劑3-MA可顯著逆轉(zhuǎn)EMAPⅡ?qū)SCs降低細(xì)胞活力的作用，提示EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生的細(xì)胞活力抑制作用與誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生的自噬有關(guān)。
　　4、低劑量EMAPⅡ作用下GSCs中未檢測(cè)到凋亡的產(chǎn)生。
　　5、低劑量EMAPⅡ可導(dǎo)致GSCs產(chǎn)生細(xì)胞周期G2/M期的阻滯，0.5h最為顯著，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞周期逐漸恢

15、復(fù)。
　　6、低劑量EMAPⅡ可誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生自噬，以0.5h最為明顯。
　　7、低劑量EMAPⅡ作用0.5h和1h可抑制GSCs中PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而可上調(diào)FoxO1的表達(dá)，促進(jìn)FoxO1的核轉(zhuǎn)錄。
　　8、低劑量EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生的自噬現(xiàn)象和G2/M期阻滯依賴于PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路。
　　9、FoxO1能夠結(jié)合到Atg2B的啟動(dòng)子區(qū)，EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生的自噬與脂滴的

16、聚集依賴于FoxO1對(duì)Atg2B的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
　　10、低劑量EMAPⅡ可抑制在體GSCs腫瘤的生長(zhǎng)，3-MA部分逆轉(zhuǎn)了EMAPⅡ?qū)SCs腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1、EMAPⅡ能夠在其選擇性開(kāi)放血腫瘤屏障的有效時(shí)間內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生對(duì)GSCs的直接殺傷作用。
　　2、EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的機(jī)制可能與EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生自噬性死亡和G2/M期阻滯相關(guān)。
　　3、EMAPⅡ可誘導(dǎo)G

17、SCs產(chǎn)生不完全自噬。
　　4、EMAPⅡ?qū)SCs產(chǎn)生腫瘤殺傷作用的分子機(jī)制之一可能與EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生不完全自噬進(jìn)而導(dǎo)致蛋白過(guò)度蓄積產(chǎn)生的蛋白毒性增加有關(guān)。
　　5、EMAPⅡ作用下GSCs中大量脂滴的聚集可能是GSCs相對(duì)于U87MG特有的一種促存活機(jī)制。
　　6、EMAPⅡ可誘導(dǎo)GSCs中PI3K/Akt/FoxO1信號(hào)通路改變。
　　7、EMAPⅡ誘導(dǎo)GSCs產(chǎn)生不完全自噬和G2/M期阻滯可能依