人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖-P(LLA-CL)支架體外構(gòu)建組織工程軟骨.pdf

1、由于創(chuàng)傷、腫瘤及退行性變等各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨損傷在臨床上常見,然而由于軟骨細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,軟骨本身缺乏血管營養(yǎng)等原因?qū)е萝浌墙M織很難自身修復(fù),從而容易導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙乃至骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生;目前臨床上修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷常用的方法如關(guān)節(jié)腔清理術(shù)、關(guān)節(jié)磨削成形術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)及微骨折術(shù)等均存在一定不足,而自體或異體軟骨細(xì)胞移植也存在來源受限及不同程度免疫排斥等問題;比較而言,軟骨組織工程無疑是最有發(fā)展前景的前沿技術(shù)。本課題通過研究人臍

2、帶沃頓膠組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及擴增探討新型組織工程種子細(xì)胞來源;并對骨髓及臍帶來源干細(xì)胞的成軟骨定向誘導(dǎo)分化能力進(jìn)行比較研究,從而優(yōu)化選擇軟骨組織工程種子細(xì)胞。制備新型殼聚糖/P(LLA-CL)軟骨組織工程多孔支架,根據(jù)組織工程的基本原理體外構(gòu)建組織工程軟骨,以期為軟骨組織工程的深入研究和發(fā)展提供一定的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　第一章人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究
　　目的：研究人臍帶沃頓膠來源間充

3、質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)并對其進(jìn)行鑒定,對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究,為組織工程種子細(xì)胞研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：無菌獲取胎兒臍帶沃頓膠組織,采用混合酶消化法獲取細(xì)胞。加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng);待細(xì)胞生長至80～90％融合時,1:3傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長形態(tài)變化,流式細(xì)胞儀檢測傳3代臍帶干細(xì)胞細(xì)胞周期及表面抗原標(biāo)志,采用MTT法測定第3、5、7代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力,通過定向誘導(dǎo)檢測臍

4、帶干細(xì)胞多向分化潛能。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)后12小時即可見少量細(xì)胞貼壁,24～48小時后大量細(xì)胞貼壁,細(xì)胞呈短梭形、梭形及多角形;細(xì)胞培養(yǎng)4～5天即進(jìn)入生長對數(shù)期,開始以集落方式生長,細(xì)胞呈均一的成纖維樣細(xì)胞形態(tài);8～10天單層細(xì)胞融合接近80％,呈漩渦樣生長。傳代后細(xì)胞貼壁和增殖速度均明顯加快,2小時左右即可見細(xì)胞貼壁,多數(shù)為成纖維細(xì)胞,細(xì)胞呈平行排列生長或旋渦狀生長。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞超過80％的細(xì)胞處

5、于G0/G1期(81.13％),表明細(xì)胞具有較強的增殖潛能。流式細(xì)胞儀檢測傳3代臍帶干細(xì)胞表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD105,不表達(dá)造血細(xì)胞表型CD45、HLA-DR和內(nèi)皮細(xì)胞特征性表型CD31;MTT法檢測結(jié)果表明第3、5、7代臍帶干細(xì)胞均有較強的體外增殖能力;經(jīng)體外定向誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可成功向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化。
　　結(jié)論：采用混合酶消化法可成功分離培養(yǎng)人臍帶沃頓膠來源干細(xì)胞,經(jīng)檢測符合間充質(zhì)干細(xì)胞基本生物學(xué)

6、特性,是軟骨組織工程良好的種子細(xì)胞來源。
　　第二章人臍帶與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨特性比較
　　目的：臍帶和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞均具有多向分化潛能,觀察人臍帶沃頓膠來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞特性及相關(guān)基因表達(dá),比較其與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化能力的差異,從而優(yōu)化選擇軟骨組織工程種子細(xì)胞。
　　方法：采用混合酶消化法從足月胎兒臍帶沃頓膠組織分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞,取第3代臍帶干細(xì)胞和平行培養(yǎng)的第3代骨

7、髓間充質(zhì)干細(xì)胞,均以2×105/cm2的密度接種后用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)其成軟骨分化;臍帶及骨髓對照組均采用普通培養(yǎng)基,不添加任何誘導(dǎo)因子。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長和形態(tài)變化;誘導(dǎo)14天后通過甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色比較觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原著色情況;采用RT-PCR技術(shù)檢測細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)過程中Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA基因表達(dá)差異。
　　結(jié)果：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸

8、變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?細(xì)胞逐漸聚集;誘導(dǎo)14天后臍帶及骨髓MSC誘導(dǎo)組甲苯胺藍(lán)染色均呈陽性,前者胞漿胞膜異染明顯呈強陽性反應(yīng);臍帶MSC對照組染色為淡藍(lán)色呈弱陽性,異染細(xì)胞數(shù)量較少,而骨髓MSC對照組細(xì)胞無異染呈陰性;Ⅱ型膠原免疫組化染色臍帶及骨髓MSC誘導(dǎo)組細(xì)胞基質(zhì)均有棕黃色著色,前者異染明顯呈強陽性反應(yīng);臍帶MSC對照組細(xì)胞胞漿內(nèi)散在淡棕色,而骨髓MSC對照組染色無異染呈陰性;R17-PCR檢測結(jié)果顯示臍帶MSC不加誘導(dǎo)情況下弱表達(dá)S

9、ox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA,誘導(dǎo)后基因表達(dá)加強(P＜0.05);骨髓MSC對照組無表達(dá),誘導(dǎo)后呈陽性反應(yīng);臍帶MSC誘導(dǎo)組基因表達(dá)顯著強于骨髓MSC誘導(dǎo)組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：臍帶和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外經(jīng)定向誘導(dǎo)均可向軟骨細(xì)胞分化,前者成軟骨能力更強;臍帶干細(xì)胞在不加誘導(dǎo)情況下有自發(fā)成軟骨分化傾向;與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比臍帶干細(xì)胞可能更適合于軟骨組織工程。
　　第三章殼聚糖/P(LLA-C

10、L)多孔泡沫支架的制備及生物相容性研究
　　目的：制備新型生物材料殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架并對其理化性質(zhì)及生物相容性進(jìn)行檢測,探討其作為軟骨組織工程支架材料的可能性。
　　方法：制備殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架,對支架行掃描電鏡觀察,測定支架孔徑、孔隙率及吸水率;分離培養(yǎng)第3代臍帶問充質(zhì)干細(xì)胞,將其與殼聚糖/P(LLA-CL)支架復(fù)合后誘導(dǎo)培養(yǎng)為實驗組,單純P(LLA-CL)聚合物支架為對照組。倒置顯

11、微鏡觀察細(xì)胞在支架上粘附及生長增殖情況,HE染色顯示細(xì)胞在支架內(nèi)部分布狀況;于接種后4、8、12、24h取樣采用細(xì)胞計數(shù)法測定細(xì)胞黏附率;分別于1、3、5、7d取樣采用MTT法分析復(fù)合支架對細(xì)胞增殖的影響;復(fù)合培養(yǎng)1周及2周時取材行掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的生長增殖以及基質(zhì)分泌情況;行裸鼠皮下包埋實驗檢測支架組織相容性。
　　結(jié)果：制備的殼聚糖/P(LLA-CL)支架為多孔泡沫狀圓柱體結(jié)構(gòu),支架表面孔隙較多;掃描電鏡顯示支架孔隙

12、分布均勻,材料內(nèi)空隙相互連通;支架孔徑為(183.56±16.78)um;孔隙率為(91.56±1.27)％;吸水率為(218.66％±1.55)％。支架材料接種細(xì)胞懸液后,細(xì)胞在支架表面及空隙內(nèi)均勻擴散,}玎巳染色顯示殼聚糖/P(LLA-CL)支架內(nèi)細(xì)胞大量存在,沿孔道均勻分布,對照組支架內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少;MTT法顯示兩種支架均對細(xì)胞生長無抑制作用,實驗組殼聚糖復(fù)合支架對細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用;細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示隨時間延長兩組材料上細(xì)胞黏

13、附率逐漸增高,各時間點實驗組支架細(xì)胞黏附率均顯著高于對照組(P＜0.05);細(xì)胞.支架復(fù)合培養(yǎng)1周及2周時掃描電鏡觀察細(xì)胞在殼聚糖/P(LLA-CL)支架上均勻分布,細(xì)胞密集生長,基質(zhì)分泌旺盛;對照組細(xì)胞分泌基質(zhì)較少。裸鼠皮下包埋實驗結(jié)果顯示P(LLA-CL)復(fù)合殼聚糖后有效降低了支架炎性反應(yīng)程度,組織相容性良好。
　　結(jié)論：殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架具備合適的孔徑及孔隙率,生物相容性良好,可作為軟骨組織工程良好的細(xì)胞

14、載體。
　　第四章臍帶干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖/P(LLA-CL)支架體外構(gòu)建組織工程軟骨
　　目的：探討臍帶干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架體外初步構(gòu)建組織工程軟骨的可能性。
　　方法：分離培養(yǎng)第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,將臍帶干細(xì)胞與預(yù)處理的殼聚糖/P(LLA-CL)多孔泡沫支架復(fù)合培養(yǎng);實驗分為誘導(dǎo)組及對照組,細(xì)胞根據(jù)分組不同分別加入成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)合培養(yǎng)3周后取出細(xì)胞支架復(fù)合物,將復(fù)

15、合物切片進(jìn)行臟染色、甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色;RT-PCR檢測各組復(fù)合物培養(yǎng)7,14,21天表達(dá)Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA的情況;Western-blot檢測Ⅱ型膠原蛋白及aggrecan蛋白表達(dá);
　　結(jié)果：細(xì)胞-材料復(fù)合誘導(dǎo)后隨著時間延長復(fù)合物表面逐漸光滑有色澤,質(zhì)地較柔韌,有類軟骨樣組織形成,而對照組復(fù)合物體積略皺縮,光澤較差;體外誘導(dǎo)培養(yǎng)3周實驗組HE染色可見陷窩樣結(jié)構(gòu),有軟骨樣基質(zhì)形成

16、;對照組則未見陷窩樣結(jié)構(gòu),細(xì)胞分泌基質(zhì)較少;甲苯胺藍(lán)染色可見誘導(dǎo)組細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)藍(lán)色異染明顯呈強陽性反應(yīng),對照組染色為淡藍(lán)色,異染不明顯呈弱陽性反應(yīng);Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示誘導(dǎo)組大量細(xì)胞內(nèi)外均有棕黃色著色呈強陽性反應(yīng),而對照組無明顯棕黃色;RT-PCR檢測結(jié)果顯示實驗組隨著誘導(dǎo)時間延長Sox-9、CoL2a1及aggrecan mRNA表達(dá)逐漸增強,而對照組各基因表達(dá)水平無明顯變化,各時間點誘導(dǎo)組和對照組mRNA表達(dá)水平兩兩比較均有