以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umhilical Cord Mesenchvmal Stem Cells hUCMSCs)的體外分離、純化及培養(yǎng)條件，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究；2.觀察hUCMSCs凍存復(fù)蘇后向脂肪細(xì)胞定向分化的能力；3.觀察蠶絲素多孔支架對(duì)hUCMSCs吸附作用及支架對(duì)hUCMSCs形態(tài)、功能及活性的影響，探討蠶絲素多孔支架與hUCMSCs構(gòu)建組織工程脂肪的可行性。 方法：1.將剔除動(dòng)靜脈的新鮮

2、人臍帶組織切成小塊培養(yǎng)，得到貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記；化學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)其體外誘導(dǎo)成脂和成骨分化的能力；RT-PCR檢測(cè)干細(xì)胞特異性標(biāo)志基因OCT-4；2.將第1代的hUCMSCs采用梯度冷凍技術(shù)凍存5個(gè)月，復(fù)蘇后培養(yǎng)至第12代時(shí)，加入成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。當(dāng)誘導(dǎo)至21天時(shí)行油紅O染色，7天及14天時(shí)用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)成脂轉(zhuǎn)化基因過(guò)氧化物酶增殖劑受體(PPARγ-2

3、)和脂蛋白酯酶(LPL)；3.將hUCMSCs制成細(xì)胞懸液接種于蠶絲素多孔支架，熒光倒置相差顯微鏡、掃描電鏡和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察其在支架上的吸附和生長(zhǎng)情況，將細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo)6周后移植于大鼠體內(nèi)，觀察細(xì)胞在支架上成脂情況。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)4-6天后，有細(xì)胞從組織塊中游出；細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第10代，無(wú)明顯的形態(tài)和增殖能力改變；細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD13、CD44，而CD14、CD34、HLA-DR表達(dá)呈陰性。體外誘

4、導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RT-PCR顯示其表達(dá)干細(xì)胞特異性因子OCT-4；2.hUCMSCs凍存復(fù)蘇后，活細(xì)胞約為86％，流式細(xì)胞儀分析這些細(xì)胞表達(dá)CD13、CD44和CD71等MSCs標(biāo)志物，不表達(dá)CD14、CD34和HLA-DR表面抗原。復(fù)蘇細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)劑的作用下，細(xì)胞中有脂滴產(chǎn)生，通過(guò)油紅O染色顯示細(xì)胞核周圍有脂滴聚集，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)有LPL及PPARγ-2 mRNA的表達(dá)。3.細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)1-

5、2天后可見(jiàn)hUCMSCs與蠶絲素多孔支架充分附著，培養(yǎng)5-7天細(xì)胞生長(zhǎng)增殖十分活躍，10天左右時(shí)，蠶絲支架孔中hUCMSCs成片狀融合。熒光倒置相差顯微鏡和掃描電鏡見(jiàn)細(xì)胞與支架黏附良好并有大量基質(zhì)分泌，且活性指標(biāo)與正常培養(yǎng)的hUCMSCs比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo)4周時(shí)，已有成脂樣細(xì)胞生成，并與蠶絲素蛋白多孔支架牢固粘附，成脂誘導(dǎo)6周，見(jiàn)大量成脂樣細(xì)胞生成；將成脂誘導(dǎo)6周的細(xì)胞-支架復(fù)合物植入大鼠體內(nèi)植入

6、4周后，可見(jiàn)有脂肪形成，8周后支架材料繼續(xù)降解，脂肪組織形成明顯，對(duì)照組支架材料逐漸降解，未見(jiàn)脂肪組織形成。 結(jié)論：1. hUCMSCs能在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增并且具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性；2.將hUCMSCs凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)至第12代，仍具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能，可作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源；3.蠶絲素多孔支架對(duì)hUCMSCs具有良好的吸附作用，并能維持其正常形態(tài)、功能及活性，蠶絲素多孔支架是hUCMSCs三維立體培