外源性TGF-β1和IGF-1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　關(guān)于體外培養(yǎng)、鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)以及誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞，目前尚缺乏相對(duì)完整和規(guī)范的實(shí)驗(yàn)方法。本課題擬通過(guò)對(duì)MSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，研究MSCs一般形態(tài)結(jié)構(gòu);通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法結(jié)合MSCs分化功能法共同鑒定MSCs;胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transfor

2、ming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞，將不同時(shí)間段內(nèi)單獨(dú)使用和聯(lián)合使用兩種誘導(dǎo)因子對(duì)所誘導(dǎo)出的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量的影響相比較;通過(guò)光鏡和電鏡研究誘導(dǎo)前后MSCs細(xì)微、超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)檢測(cè)TGF-β1和IGF-1對(duì)MSCs增殖能力的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)MSCs作為組織工程氣管軟骨種子細(xì)胞和體外構(gòu)建組織工程氣管軟骨提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)可行性。
　　方法:
　　1 MSCs獲

3、取、培養(yǎng)、純化與鑒定
　　1.1 MSCs獲取、培養(yǎng)及純化:①頸椎脫臼處死大鼠，無(wú)菌條件下分離大鼠股骨和脛骨，取骨髓;②通過(guò)換液及傳代去除雜質(zhì)細(xì)胞。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　1.2 MSCs的鑒定:①形態(tài)學(xué)鑒定免疫熒光法;②表型鑒定流式細(xì)胞術(shù);③功能鑒定誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞。
　　1.3 MTT法檢測(cè)采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應(yīng)比色法檢測(cè)TGF-β1、IGF-1及TGF-β1+IGF-1對(duì)MSCs增殖

4、能力的影響。
　　1.4掃描電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)前形態(tài)。
　　1.5透射電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)前形態(tài)。
　　2誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞。
　　2.1體外誘導(dǎo)及分組根據(jù)誘導(dǎo)分化因子使用方法，實(shí)驗(yàn)分四組:A組:50ng/ mlIGF-1和10ng/ml TGF-β1。 B組:10ng/ml TGF-β1。C組:50ng/ml IGF-1。對(duì)照組:單獨(dú)使用DMEM高糖培養(yǎng)基，不加誘導(dǎo)分化因子。A、B、C組在DMEM

5、高糖培養(yǎng)基里加入維生素C50μg/ml、胰島素6.25μg/ml、地塞米松51.6ng/ml作為基礎(chǔ)誘導(dǎo)分化液。取第四代MSCs按1×105/ml接種于六孔板，內(nèi)置蓋玻片行細(xì)胞爬片。光鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)改變。
　　2.2掃描電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化。
　　2.3透射電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化。
　　2.4 MSCs誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞后鑒定:①Ⅱ型膠原免疫熒光染色②RT-PCR檢測(cè)③Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化

6、學(xué)染色，多種方法共同鑒定MSCs誘導(dǎo)出的軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1光鏡觀察原代培養(yǎng)24h后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，大部分細(xì)胞呈梭型、三角形，小部分呈圓形。3代后細(xì)胞純化，MSCs形態(tài)均一，雜質(zhì)細(xì)胞極少見(jiàn)。誘導(dǎo)7d后MSCs形態(tài)開(kāi)始發(fā)生改變，逐漸轉(zhuǎn)變成三角形、星形、多邊形，21d后絕大多數(shù)MSCs呈三角形、星形、多邊形細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)多個(gè)突起。
　　2 MSCs鑒定①流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞廣泛高度表達(dá)CD

7、90、CD29，而極少表達(dá)CD34、CD45。②MSCs免疫熒光顯示MSCs表達(dá)CD90、CD29陽(yáng)性率在99％以上，而不表達(dá)CD34、CD45。
　　3 MTT法檢測(cè) A組、B組和C組增殖活性高于對(duì)照組(P＜0.05)。TGF-β1、IGF-1可增強(qiáng)MSCs增殖活性。
　　4掃描電鏡觀察MSCs呈長(zhǎng)梭形，扁平伸展?fàn)?，可?jiàn)突起。誘導(dǎo)兩周MSCs體積增大，呈多邊形、三角形、星形，可見(jiàn)多個(gè)突起。
　　5透射電鏡觀察MSCs

8、誘導(dǎo)前透射電鏡見(jiàn)一個(gè)細(xì)胞核，可見(jiàn)一個(gè)核仁。胞漿見(jiàn)線粒體。細(xì)胞誘導(dǎo)7d后細(xì)胞核增大，核仁增多。誘導(dǎo)14d見(jiàn)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡較7d時(shí)增加，可見(jiàn)較多的微絨毛和脂滴。誘導(dǎo)21d空泡和脂滴增加，可見(jiàn)數(shù)個(gè)髓鞘樣小體。
　　6 MSCs誘導(dǎo)出軟骨細(xì)胞后鑒定:
　　6.1Ⅱ型膠原免疫熒光染色誘導(dǎo)21d后，A組、B組免疫熒光顯示胞漿呈棕紅色，高度表達(dá)Ⅱ型膠原，而C組和對(duì)照組結(jié)果呈陰性。
　　6.2 RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)R

9、T-PCR結(jié)果顯示A組和B組電泳中可見(jiàn)Ⅱ型膠原擴(kuò)增條帶，呈陽(yáng)性，C組和對(duì)照組呈陰性。
　　6.3Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色A組和B組Ⅱ型膠原染色呈陽(yáng)性，胞漿呈棕黃色。而C組和對(duì)照組結(jié)果呈陰性。以JEDR8010D形態(tài)圖像分析軟件VESION1.0掃描，結(jié)果顯示A組Ⅱ型膠原表達(dá)量比B組顯著提高(P＜0.01)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸增加。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓培養(yǎng)+貼壁純化法分離培養(yǎng)MSCs，培養(yǎng)出大量高

10、度純化的MSCs，可滿足MSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程氣管軟骨需求，全骨髓培養(yǎng)+貼壁純化法是值得推薦的MSCs培養(yǎng)方法。流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法結(jié)合MSCs分化功能法是目前MSCs較為理想的鑒定方法。TGF-β1與IGF-1對(duì)MSCs均有促增殖作用，MSCs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞時(shí)細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)改變提示細(xì)胞分化、代謝功能旺盛。聯(lián)合使用TGF-β1、IGF-1誘導(dǎo)MSCs在體外定向分化為軟骨細(xì)胞，TGF-β1和IGF-1協(xié)同刺激MSCs分化為