TGF-β-,1-腺病毒載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）向軟骨細胞轉(zhuǎn)化的實驗研究.pdf

1、目的：探討用轉(zhuǎn)化生長因子β<,1>腺病毒表達載體(Ad-TGFβ<,1>)轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)向軟骨細胞表型分化，觀察轉(zhuǎn)染Ad-TGFβ<,1>對細胞分化的影響，為高效獲取軟骨組織工程種子細胞提供實驗基礎(chǔ)。 方法：選用二月齡新西蘭兔，自脛骨上端抽取骨髓4ml，用70％Percoll(1.073g／min)，2000r／min，離心20min后吸取單核細胞層，H-DMEM不全培養(yǎng)基洗滌2次，加入H-DMEM完全培養(yǎng)基

2、(含10％FBS)，接種于培養(yǎng)瓶中，5％C02，37℃孵箱中培養(yǎng)，3-4天換液一次，每次換液時將未貼壁細胞全部倒掉，待細胞85％融合，用0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，傳代擴增，取第二代MSCs以1×10<'5>cells／cm<'2>接種于24孔培養(yǎng)板中(內(nèi)含有玻片)和25cm<'2>的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)．待細胞達70％融合，分成三組：空白組、對照組、實驗組．空白組用H-DMEM全培養(yǎng)基；對照組用H-DMEM(無血清)培養(yǎng)基，腺

3、病毒(無TGF-β<,1>)，地塞米松100nmol／1，維生素C50mg／l；實驗組用H-DMEM(無血清)培養(yǎng)基，腺病毒(含TGF-β<,1>)，地塞米松100nmol／l，維生素C50mg／1；2-3d換液，倒置顯微鏡逐日觀察細胞生長情況。分別于誘導7、14、21、28d，取出蓋玻片進行甲苯胺藍染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色；收集培養(yǎng)瓶中細胞，超聲破碎存放于-80℃冰箱中，Western blot備用。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的增殖緩

4、慢，約需10-14天才能傳代：細胞形態(tài)逐漸延伸，成梭形，集落融合，傳代后細胞呈均一長梭形，緊密排列類似漩渦。實驗轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)多樣，第7d、14d、21d、28d、TGFβ<,1>強陽性表達，甲苯胺藍染色明顯異染，免疫印記和免疫組化方法檢測MSCs內(nèi)Ⅱ型膠原強表達，而空白組和對照組均為弱陽性或陰性，并有顯著差異。 結(jié)論：①MSCs是軟骨組織工程研究中非常有希望的種子細胞，在適當?shù)臈l件下可迅速擴增，解決種子細胞數(shù)量不足的現(xiàn)狀；②T