IGF-1基因轉(zhuǎn)染兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨容易發(fā)生損傷和退變，再生能力差，對軟骨損傷的實驗治療主要集中在細(xì)胞治療上，包括應(yīng)用成熟軟骨細(xì)胞、軟骨祖細(xì)胞及其他細(xì)胞等。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)作為成熟軟骨細(xì)胞的替代品越來越受到重視。ADSCs可以很容易從脂肪組織中獲得，增殖傳代能力強(qiáng)，細(xì)胞均一性好，具多向分化潛能，能分化為各種類型組織，包括軟骨和骨。但轉(zhuǎn)移的ADSCs在軟骨缺損部位還沒有產(chǎn)生令人滿意的關(guān)節(jié)軟骨，一個可能的問題是局部沒有足夠能刺激移植細(xì)胞分化的細(xì)胞因子。體

2、外研究報告顯示，特異的蛋白因子能夠促進(jìn)成人ADSCs向軟骨分化，提高體內(nèi)軟骨修復(fù)能力。相關(guān)的研究表明TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，F(xiàn)GF，BMP-2，BMP-6，IGF-1等生長因子具有成軟骨能力，因此可以在局部加入這些因子促進(jìn)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化。但外源性細(xì)胞因子易于流失、作用時間短、價格昂貴。故設(shè)想將這些細(xì)胞因子的基因?qū)階DSCs中，通過自分泌相應(yīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞分化，以此基因修飾的ADSCs作為種

3、子細(xì)胞來構(gòu)建組織工程軟骨，用于軟骨缺損和退變的治療將具有重要意義。 目前，應(yīng)用IGF-1基因轉(zhuǎn)染ADSCs國內(nèi)外尚未見報道。本研究采用I型膠原酶消化法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，對存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離、純化培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，對其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究。利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法將IGF-1轉(zhuǎn)入ADSCs，G418篩選陽性克隆細(xì)胞并結(jié)合低血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化，為軟骨缺損及退變的基因治療奠定基礎(chǔ)。 材料

4、與方法： 一、實驗材料 新西蘭大白兔，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。 二、實驗方法 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)活性觀察 (1)兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)采用I型膠原酶消化后貼壁培養(yǎng)的方法，分離、純化兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。 (2)向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)抗壞血酸、地塞米松及β-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化。堿性磷酸酶及茜素紅染色鑒定成骨細(xì)胞。 (3)生物學(xué)性狀

5、的觀察用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞的生長情況并拍照。 2、IGF-1基因轉(zhuǎn)染兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的實驗研究 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的擴(kuò)增純化及鑒定。 (2)建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs細(xì)胞株，RT-PCR及Western blot檢測IGF-1表達(dá)。 (3)相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并1％甲苯胺藍(lán)染色。 (4)MTT法繪制基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞

6、增殖曲線，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。 (5)免疫熒光法檢測Ⅱ型膠原表達(dá)。 (6)透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： 1、兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)成功 (1)I型膠原酶消化脂肪組織分離得到的細(xì)胞大多為圓形單個核細(xì)胞，貼壁生長后，原代及傳代細(xì)胞生長狀態(tài)良好，各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，為長梭形。 (2)抗壞血酸、地塞米松及β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組ADSCs ALP及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)陽性。 2、

7、通過基因轉(zhuǎn)染IGF-1，ADSCs成功誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞 (1)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1擴(kuò)增、純化成功。 (2)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs細(xì)胞株。 (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞變圓并聚集呈結(jié)節(jié)樣生長，1％甲苯胺藍(lán)染色陽性。 (4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，流式細(xì)胞S期比例增大，G1期比例減小，p<0.05。 (5)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞