網(wǎng)格蛋白和微囊在LPS致血管通透性增高中的作用及機(jī)制.pdf

1、血管通透性增高是嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥患者的重要病理改變，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮屏障受損，對液體、血漿蛋白、大分子物質(zhì)的通透性增高，導(dǎo)致組織水腫，促進(jìn)內(nèi)環(huán)境紊亂等合并癥發(fā)生，研究闡明血管通透性增高的發(fā)生機(jī)制有助于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、改善療效和提高存活率。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是膿毒癥的重要啟動(dòng)因子，目前認(rèn)為LPS引起血管通透性增高主要有兩條途徑:“細(xì)胞間”途徑和“跨細(xì)胞”途徑。其中，“細(xì)胞間”途徑開放主要由內(nèi)皮細(xì)胞張力絲形

2、成并收縮引起，并認(rèn)為是調(diào)節(jié)血管通透性增高的主要途徑。然而近來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞張力絲聚合發(fā)生在LPS作用后的早期，4h后細(xì)胞骨架解聚重構(gòu)，張力絲消失，提示LPS誘導(dǎo)血管通透性增高還存在其他調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　根據(jù)基礎(chǔ)研究，黏附連接是血管內(nèi)皮細(xì)胞間（除血腦屏障外）的主要連接方式，其主要結(jié)構(gòu)蛋白血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cad)被胞吞可以引起黏附連接強(qiáng)度降低、細(xì)胞間隙開放和血管通透性增

3、高。以往研究表明，VE-cad在細(xì)胞質(zhì)膜的表達(dá)取決于被胞吞的多少，而VE-cad的胞吞主要受網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)，但近來有研究發(fā)現(xiàn)，上皮鈣粘蛋白(epithelial cadherin，E-cad)的胞吞可以通過非網(wǎng)格蛋白途徑——細(xì)胞質(zhì)膜微囊(caveolae，簡稱微囊)途徑完成，例如在人表皮樣癌細(xì)胞和胰腺導(dǎo)管癌上皮細(xì)胞，微囊可以胞吞E-cad，引起上皮細(xì)胞間黏附連接破壞、細(xì)胞分離和腫瘤轉(zhuǎn)移。那么，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞是否參

4、與了LPS誘導(dǎo)的血管通透性增高，機(jī)制如何？
　　據(jù)此，我們以CRL-2922內(nèi)皮細(xì)胞株為研究對象，研究內(nèi)容為以下三部分:①觀察網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用;②探討網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞導(dǎo)致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的機(jī)制;③探討LPS作用后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞途徑轉(zhuǎn)換的機(jī)制。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊

5、介導(dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　?。ㄒ唬┚W(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　　1.采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，檢測LPS(10μg/mL)作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)、單層細(xì)胞通透性，觀察變化規(guī)律。
　　2.采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，觀察LPS作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后網(wǎng)格蛋白與VE-ca

6、d的免疫共沉淀和共定位。
　　3.采用網(wǎng)格蛋白胞吞抑制劑CPZ(100μmol/L)和網(wǎng)格蛋白重鏈siRNA(50nmol/L)，觀察其對LPS作用(1h和4h)后網(wǎng)格蛋白與VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及單層細(xì)胞通透性的影響。
　?。ǘ┪⒛医閷?dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　　1.采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，觀察LPS作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后

7、Cav1與VE-cad的免疫共沉淀和共定位。
　　2.采用微囊抑制劑filipin(5μg/mL)和Cav1 siRNA(50 nmol/L)，觀察其對LPS作用(1h和4h)后Cav1與VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及單層細(xì)胞通透性的影響。
　　3.采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，觀察LPS作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后微囊主要結(jié)構(gòu)蛋白Cav1的蛋白表達(dá)和磷酸化(Tyr14)，以及S

8、rc的蛋白表達(dá)的變化，并觀察Src抑制劑SU6656(2μmol/L)和TLR4抑制劑CLI-095(5μg/mL)對LPS作用(1h和4h)后的Cav1磷酸化(Tyr14)、Cav1與VE-cad的免疫共沉淀、P-Cav1與VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及單層細(xì)胞通透性的影響。
　　第二部分網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞導(dǎo)致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的機(jī)制
　　1.采用人血管內(nèi)皮

9、細(xì)胞株CRL-2922，觀察LPS作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后VE-cad與Rab11（循環(huán)內(nèi)顆粒標(biāo)志物）的免疫共沉淀、VE-cad與LAMP2(次級內(nèi)顆粒/溶酶體標(biāo)志物)的免疫共沉淀的變化。
　　2.采用網(wǎng)格蛋白胞吞抑制劑CPZ和微囊抑制劑filipin，觀察其對LPS作用(1h和4h)后VE-cad與Rab11的免疫共沉淀、VE-cad與LAMP2的免疫共沉淀的影響。
　　第三部分 LPS作用后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和

10、微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞途徑轉(zhuǎn)換的機(jī)制
　　1.采用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-2922，觀察LPS作用不同時(shí)間(1h、2h、4h和6h)后細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。
　　2.采用細(xì)胞骨架解聚劑Cyt D(2μmol/L)和細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑Jasp(1μmol/L)，觀察其對LPS作用(1h和4h)后網(wǎng)格蛋白與VE-cad的免疫共沉淀、Cav1與VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad與Rab11的免疫共沉淀、VE-cad與LAMP2的

11、免疫共沉淀、VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及單層細(xì)胞通透性的影響。
　　主要結(jié)果:
　　一、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　?。ㄒ唬┚W(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　　1.正常對照組中VE-cad在質(zhì)膜蛋白表達(dá)高，LPS(10μg/mL)作用后VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)逐漸降低(P＜0.05），VE-cad的總蛋白表達(dá)也逐漸降低（P＜0.

12、05）。LPS作用后單層細(xì)胞通透性呈時(shí)間依賴性的增高（P＜0.05）。
　　2.LPS作用后網(wǎng)格蛋白的表達(dá)逐漸降低（P＜0.05）;網(wǎng)格蛋白與VE-cad的免疫共沉淀在LPS作用1h后增高(P＜0.05），然后逐漸降低;免疫組合激光共聚焦顯微鏡觀察到網(wǎng)格蛋白與VE-cad的共定位在LPS作用1h后增高，在LPS作用4h后降低。
　　3.網(wǎng)格蛋白胞吞抑制劑CPZ(100μmol/L)和網(wǎng)格蛋白重鏈siRNA(50 nmol/L

13、)可以顯著降低LPS作用1h后網(wǎng)格蛋白與VE-cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增高LPS作用1h后VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)(P＜0.05），改善LPS作用1h后的單層細(xì)胞通透性(P＜0.05);但對LPS作用4h后網(wǎng)格蛋白與VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及單層細(xì)胞通透性沒有顯著影響。
　?。ǘ┪⒛医閷?dǎo)的VE-cad胞吞在LPS誘導(dǎo)血管通透性增高中的作用
　　1.LPS作用后，Cav1與VE-ca

14、d的免疫共沉淀在正常對照組中幾乎未見，隨著LPS作用時(shí)間延長而逐漸增高（P＜0.05），免疫組化激光共聚焦顯微鏡觀察其共定位也發(fā)現(xiàn)在LPS作用4h后有明顯的共定位。
　　2.微囊抑制劑非律平(5μg/mL)和Cav1 siRNA(50 nmol/L)可以顯著降低LPS作用4h后Cav1與VE-cad的免疫共沉淀，并增高VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)，以及改善單層細(xì)胞通透性(P＜0.05)。
　　3.LPS作用后，微囊主要的蛋白成分

15、Cav1的蛋白表達(dá)無顯著變化，但其Tyr14位點(diǎn)磷酸化水平卻逐漸增高(P＜0.05），Src蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性的增高(P＜0.05），TLR4抑制劑CLI-095(5μg/mL)可顯著降低LPS作用4h后增高的Src蛋白表達(dá)。Src抑制劑SU6656(2μmol/L)和TLR4抑制劑CLI-095(5μg/mL)可顯著降低LPS作用4h后的Cav1磷酸化(Tyr14)，減少Cav1與VE-cad的免疫共沉淀以及P-Cav1與VE-ca

16、d的免疫共沉淀（P＜0.05），增加VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)(P＜0.05)，以及單層細(xì)胞通透性顯著降低(P＜0.05）。
　　二、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞導(dǎo)致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的機(jī)制
　　1.LPS作用后，VE-cad與Rab11的免疫共沉淀在1h增高(P＜0.05)，隨后逐漸降低;VE-cad與LAMP2的免疫共沉淀在正常時(shí)幾乎未見，但隨LPS作用時(shí)間延長，呈時(shí)間依賴性的增高（P＜0.0

17、5）。
　　2.LPS作用1h后增高的VE-cad與Rab11免疫共沉淀可以被網(wǎng)格蛋白胞吞抑制劑CPZ顯著抑制(P＜0.05），但不受微囊抑制劑非律平的影響;LPS作用4h后增高的VE-cad與LAMP2的免疫共沉淀可以被微囊抑制劑顯著抑制（P＜0.05），但不受網(wǎng)格蛋白胞吞抑制劑的影響。
　　三、LPS作用后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞途徑轉(zhuǎn)換的機(jī)制
　　1.正常對照組中，肌動(dòng)蛋白呈均勻散在分布，細(xì)胞骨架

18、無明顯的聚合;LPS作用1h后，肌動(dòng)蛋白聚集呈點(diǎn)片狀，發(fā)生明顯聚合，可見細(xì)胞中細(xì)長的張力絲形成;4h后肌動(dòng)蛋白重新顯示出散在分布的趨勢，細(xì)胞骨架解聚，張力絲幾近消失。
　　2.細(xì)胞骨架解聚劑Cyt D可顯著抑制LPS作用1h后增高的網(wǎng)格蛋白與VE-cad以及VE-cad與Rab11免疫共沉淀（P＜0.05），顯著增高Cav1與VE-cad以及VE-cad與LAMP2的免疫共沉淀（P＜0.05），顯著降低VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)(P

19、＜0.05)，并加重LPS作用1h后的單層細(xì)胞通透性增高(P＜0.05）。在LPS作用1h后給予細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑Jasp處理，可以顯著降低LPS作用4h后的Cav1與VE-cad以及VE-cad與LAMP2的免疫共沉淀(P＜0.05），增高LPS作用4h后的VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)(P＜0.05)，并改善LPS作用4h后的單層細(xì)胞通透性（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞均參與了LP

20、S誘導(dǎo)的血管通透性增高，網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的VE-cad胞吞主要發(fā)生在LPS作用的早期(1～2h)，而微囊介導(dǎo)的VE-cad胞吞主要發(fā)生在LPS作用后期(4h)，并由LPS-TLR4-Src信號途徑激活。
　　2.VE-cad經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞后位于循環(huán)內(nèi)顆粒中，導(dǎo)致LPS作用早期(1～2h)VE-cad質(zhì)膜蛋白表達(dá)丟失和單層細(xì)胞通透性有限的增高，而VE-cad經(jīng)微囊介導(dǎo)的胞吞后位于次級內(nèi)顆粒/溶酶體中，導(dǎo)致后期(4h)嚴(yán)重的VE-c