基于環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)的人類腸道病毒區(qū)域性流行型別變遷及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、背景：
　　腸道病毒(Enteroviruses，EV)是生活在人類腸道中的一類常見病毒，多為無(wú)癥狀感染，但也可引起多種嚴(yán)重的或潛在的致死性疾病如脊髓灰質(zhì)炎、腦炎、手足口病、出血性結(jié)膜炎和急性心肌炎等。近年的研究還表明，EV感染與某些慢性疾病有關(guān)，如Ⅰ型糖尿病、甲狀腺炎等。
　　EV在世界范圍內(nèi)廣泛分布，無(wú)明顯地域性差異。隨著當(dāng)前各國(guó)間國(guó)際交流日益頻繁，EV流行范圍早已超過(guò)人們最初的預(yù)期，并且自然界中EV生存環(huán)境的改變很可能

2、會(huì)加速病毒的變異。EV所致疾病主要為散發(fā)或呈地區(qū)性暴發(fā)。在非流行期，特定區(qū)域通常有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)型別共循環(huán)，而在暴發(fā)時(shí)期，往往會(huì)在同一地區(qū)分離到大量同一型別毒株。長(zhǎng)期以來(lái)，EV感染是嚴(yán)重威脅公眾特別是兒童健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，加強(qiáng)EV分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，對(duì)于預(yù)防控制EV相關(guān)疾病具有重要理論和實(shí)際意義。
　　EV以隱性感染為主，隱性感染者可持續(xù)數(shù)周向外環(huán)境排泄大量病毒，故EV常在下水道污水、江河水中檢出，甚至污染飲用水水源。

3、環(huán)境中的EV可以通過(guò)不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行濃縮、分離及鑒定，以作為EV流行病學(xué)研究的一個(gè)補(bǔ)充方法，稱為環(huán)境監(jiān)測(cè)。生活污水是特定地區(qū)EV在環(huán)境中的豐富來(lái)源。環(huán)境監(jiān)測(cè)可以獲得特定地區(qū)EV的循環(huán)信息，包括有癥狀的感染和隱性感染，并有可能在人群產(chǎn)生臨床癥狀之前就在生活污水中檢出EV。EV在環(huán)境水體中廣泛存在，可在多種環(huán)境水體中被分離，但其滴度相對(duì)較低，且容易在水中懸浮物上附著，比臨床標(biāo)本更難檢出。因此，環(huán)境水體標(biāo)本檢測(cè)前必須進(jìn)行大量水體的濃縮富集，

4、這是決定EV能否成功分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膜吸附-洗脫法是目前實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的濃縮方法，在病毒的環(huán)境監(jiān)測(cè)以及相關(guān)疾病的病原體檢測(cè)方面可以發(fā)揮很大作用。
　　EV是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，近年來(lái)對(duì)其進(jìn)行了廣泛的流行病學(xué)及病毒學(xué)研究。目前，全球已有相當(dāng)數(shù)量的國(guó)家開展環(huán)境生活污水標(biāo)本的監(jiān)測(cè)研究，以了解當(dāng)?shù)丶顾杌屹|(zhì)炎（脊灰）病毒(Poliovirus，PV)和非脊灰腸道病毒(Non-polioEnteroviruses，NPEV)的循環(huán)狀況和

5、開展相關(guān)研究，而國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域研究較少。
　　目的：
　　1.在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化環(huán)境生活污水標(biāo)本中EV的濃縮分離方法，以完善方法學(xué)，提高檢測(cè)效率;探討污水標(biāo)本中懸浮顆粒物對(duì)病毒吸附和分離的影響。
　　2.通過(guò)環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)，明確2012～2014年山東地區(qū)EV型別分布、傳播和頻率，為相關(guān)疾病的流行病學(xué)研究提供支持。
　　3.補(bǔ)充完善山東省環(huán)境生活污水標(biāo)本EV分離株各型別的VP1區(qū)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，研究山東省

6、EV的基因特征和長(zhǎng)期循環(huán)動(dòng)態(tài)變化，為EV分子流行病學(xué)研究提供有價(jià)值的補(bǔ)充。
　　方法：
　　1.環(huán)境監(jiān)測(cè):本研究選擇濟(jì)南市光大污水處理廠、臨沂市首創(chuàng)水務(wù)公司作為采樣點(diǎn)，之后在2013年9月又納入煙臺(tái)市辛安河污水處理廠作為采樣點(diǎn)，分別在其生活污水的入口處采用定時(shí)采樣法采集污水標(biāo)本，使用陰離子膜吸附-超聲波振蕩法進(jìn)行濃縮富集，接種RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。
　　2.病例監(jiān)測(cè):本研究選擇山東省2012～2014年急性

7、弛緩性麻痹(AFP)和急性腦膜炎腦炎綜合癥(AMES)兩種疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中分離的EV進(jìn)行分析。
　　3.基因擴(kuò)增及型別鑒定:提取病毒RNA，使用RT-PCR擴(kuò)增VP1編碼區(qū)，對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。將各分離株的VP1編碼區(qū)序列通過(guò)與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)而確定EV血清型別。
　　4.生物信息學(xué)分析:使用BioEdit7.0.9.0軟件，對(duì)生活污水和病例標(biāo)本中的EV分離株以及GenBank中公布

8、的相關(guān)EV VP1核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。使用MEGA5.0軟件，通過(guò)鄰位法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，建樹的可靠性通過(guò)1000 Bootstrap評(píng)估。通過(guò)比較，研究山東地區(qū)EV的基因特征、變異及其進(jìn)化來(lái)源。
　　結(jié)果：
　　1.陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化:通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)，比較不同pH值洗脫液和不同超聲波振蕩次數(shù)對(duì)EV的回收率，確定最優(yōu)洗脫條件為:洗脫液pH為9.0，超聲振蕩時(shí)間設(shè)定

9、為振蕩1次，持續(xù)3 min。
　　2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV的吸附作用:環(huán)境污水為酸性時(shí)，有利于EV吸附到懸浮顆粒物上;EV含量對(duì)懸浮顆粒物的吸附作用基本沒(méi)有影響。環(huán)境污水中懸浮顆粒物濃度增加，吸附到顆粒物上的病毒滴度及吸附率呈上升趨勢(shì)，吸附在其中的病毒的洗脫率呈明顯下降趨勢(shì)，總體的顆粒物回收效率在特定的濃度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。環(huán)境污水標(biāo)本中懸浮顆粒物對(duì)E-3的吸附作用較強(qiáng)，對(duì)E-6的吸附作用較弱。
　　3.環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)

10、測(cè)標(biāo)本的采集和病毒分離情況:2012～2014年環(huán)境監(jiān)測(cè)標(biāo)本共分離到EV2010株，包括NPEV1468株，優(yōu)勢(shì)血清型別為E-7、CV-B5、E-6、E-3、E-11、CV-B3;PV542株，其中發(fā)現(xiàn)1株Ⅰ型疫苗衍生株脊灰病毒(VDPV)E12-221，以及12株高變異株病毒(pre-VDPV)。各市不同月份的NPEV型別譜各有不同，不同血清型別的毒株有不同的時(shí)間循環(huán)模式。AFP監(jiān)測(cè)病例共分離到NPEV119株，包括27種型別;PV3

11、5株，未檢出VDPV毒株及PV野毒株。2014年AMES監(jiān)測(cè)病例中，收集標(biāo)本798份，分離到EV152株，陽(yáng)性率為19.1％。其中，CV-B5、E-6、E-30分離數(shù)目較多，占總分離數(shù)的92.8％，還分離到E-7、E-25及1例E-3與E-6的混合感染。
　　4.EV優(yōu)勢(shì)血清型別的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析:E-7分離數(shù)目最多，分離株之間同源性較低，存在多個(gè)傳播鏈共循環(huán)。E-3核苷酸和氨基酸變異較小，在遺傳進(jìn)化上較為穩(wěn)定，具有明顯的

12、時(shí)間和地域聚集性。CV-B5分離株之間同源性較高，存在兩個(gè)傳播鏈，在山東省內(nèi)傳播迅速，廣泛流行。CV-B3分離株之間核苷酸差異較小，進(jìn)化分支具有明顯的時(shí)間聚集特征。E-6分離株核苷酸差異較大，保持著較快的進(jìn)化速度，山東省內(nèi)存在至少兩條傳播鏈的共循環(huán)。E-11分離株包括Gergory-like和Silva-like毒株，分為明顯的兩個(gè)進(jìn)化分支，之間的核苷酸差異較大。
　　結(jié)論：
　　1.根據(jù)加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)優(yōu)化洗脫液pH

13、值、超聲振蕩時(shí)間和次數(shù)，確定了污水標(biāo)本的陰離子膜吸附-超聲波振蕩法的最優(yōu)洗脫條件。
　　2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV具有較強(qiáng)的吸附作用，并受到多種因素的影響，其分離型別構(gòu)成與上清中差異不大，但各血清型別分離率存在差異。建立了從懸浮顆粒物中洗脫濃縮EV的方法。在今后的環(huán)境監(jiān)測(cè)中，應(yīng)綜合采用污水上清和懸浮顆粒物進(jìn)行分離分析。
　　3.環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)中主要分離到的是EV-B組病毒，A組、C組病毒分離株數(shù)較少。NPEV分離株的

14、優(yōu)勢(shì)血清型別為E-7、CV-B5、E-6、E-3、E-11、CV-B3。各市不同月份的NPEV型別譜各有不同，不同血清型別的毒株有不同的時(shí)間循環(huán)模式。
　　4.環(huán)境污水中分離到的PV均為疫苗株，無(wú)野病毒。國(guó)內(nèi)首次從環(huán)境污水中發(fā)現(xiàn)疫苗衍生株脊灰病毒。
　　5.山東省EV各優(yōu)勢(shì)血清型分離株進(jìn)化速度較快，變異活躍，存在多條傳播鏈的共同流行，環(huán)境監(jiān)測(cè)與病例監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)株之間存在一定的遺傳進(jìn)化關(guān)系。
　　6.環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)EV具有較高的